【正文】 養(yǎng)。 ? 接種試驗動物進行培養(yǎng)。用這些培養(yǎng)基培養(yǎng)厭氧菌時，先將培養(yǎng)基煮沸 15－ 30分鐘，降溫后在培養(yǎng)基表面加一層滅菌的液體石蠟，然后接種培養(yǎng)。 ? 物理學(xué)方法 利用加熱、密封、抽氣等物理學(xué)方法，以驅(qū)除或隔絕培養(yǎng)環(huán)境或培養(yǎng)基中的養(yǎng)氣，形成無氧狀態(tài)，以利于厭氧菌的生長。 含二氧化碳條件下的細菌培養(yǎng) ? 有些細菌特別是初次分離培養(yǎng)，在含有 5％－ 10％ CO2環(huán)境下生長良好，培養(yǎng)時，可直接利用二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照需要調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱內(nèi)二氧化碳的濃度。此時容器內(nèi)含有較高濃度的二氧化碳，將容器放入適宜溫度培養(yǎng)。 除少數(shù)病毒外，大多數(shù)動物病毒能在試驗動物、受精卵和細胞培養(yǎng)中增殖。常用弱碳酸氫鹽來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的 pH值，培養(yǎng)液的 pH值一般維持在 。有些復(fù)雜的培養(yǎng)基，還需添加其它糖類或簡單的化合物如乳酸、丙酮酸及醋酸，或代替葡萄糖。維持細胞生長的最低營養(yǎng)要求需要以下 13種氨基酸。使用較多的維生素主要是 B族維生素，復(fù)雜的培養(yǎng)液中還含有還原劑、谷胱甘肽、抗壞血酸及 L－半胱氨酸。 ? 5) 蛋白質(zhì) 動物血清是蛋白質(zhì)的主要來源，常用的有胎牛血清或犢牛血清。 ? 6）抗生素 控制細胞培養(yǎng)中細菌的污染，常用的抗生素有青霉素、鏈霉素、制霉菌素或兩性霉素 B。病毒對原代細胞易感，繁殖滴度高，且無致瘤性等。 細胞培養(yǎng)類型 ? 2） 二倍體細胞株 原代細胞 → 次代細胞 → 多次連續(xù)傳代成為二倍體細胞。不能在體外無限制傳代，從幾代至幾十代，兼有原代細胞和傳代細胞的優(yōu)點，病毒對其易感，質(zhì)量可控，適用于繁殖病毒?？稍隗w外無限制的傳代，其染色體數(shù)不正常，成為異倍體。但存在潛在的致瘤性，要求背景情況應(yīng)詳細，并作系統(tǒng)鑒定合格后，方可用于繁殖病毒生產(chǎn)滅活疫苗。 ? 2) 細胞復(fù)蘇 將安瓶自液氮罐取出后立即放入 37～ 40℃ 溫水中，在 lmin之內(nèi)使細胞融化，換液培養(yǎng)至形成細胞單層。細胞懸液裝于冰盒保持溫度在 15～ 25℃ 左右。 ? 2）轉(zhuǎn)動培養(yǎng) 將制備好的細胞懸液分裝在玻璃或塑料轉(zhuǎn)瓶中，密閉瓶口，置轉(zhuǎn)瓶機上，以每小時 5－ 10轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)動培養(yǎng)，細胞在轉(zhuǎn)動培養(yǎng)時，貼附于瓶壁四周，長成細胞單層后，接種病毒懸液， 37－ 38?C左右繼續(xù)轉(zhuǎn)動培養(yǎng)。由于懸浮培養(yǎng)細胞能及時得到充足的營養(yǎng)和養(yǎng)氣，細胞生長速度快，產(chǎn)量高，可以得到大量的細胞。微載體培養(yǎng)可采用通氣攪拌法，也可采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法進行。種雞群必須定期監(jiān)測，不得含有繁殖病毒的相應(yīng)抗體。也可將氣室向上放于蛋盤中，在氣室距邊緣約 。 雞胚接種途徑和接種方法 ? 2）絨毛尿囊膜途徑 在氣室中心鉆一小孔，直接從氣室處刺入針頭約 ，滴入 － ，繼續(xù)垂直刺入針頭，穿過卵膜和絨毛尿囊膜，拔出針頭。 ? 3）卵黃囊途徑 在氣室中心鉆一小孔，垂直刺入針頭約3cm，注入接種物 － ，用石蠟封口，繼續(xù)孵化。 雞胚接種途徑和接種方法 ? 4）羊膜腔途徑 將氣室端靠近胚胎側(cè)的卵殼鋸穿，在卵膜上滴入一滴無菌液體石蠟或生理鹽水，避開血管，在氣室處刺入針頭約 ，在氣室內(nèi)的卵膜上滴入 －，繼續(xù)垂直刺入針頭，穿過卵膜和絨毛尿囊膜，拔出針頭。 ? 5）靜脈途徑 畫出直而粗的靜脈處位置，卵殼，加一滴液體石蠟，使卵膜透明。 接種后的檢查及病毒的收獲 ? 接種后一般在 37?C左右繼續(xù)孵化 2－ 7天，不必翻蛋。 ? 觀察期結(jié)束，所有活胚同樣冷卻處理。收獲期間注意檢查胚胎、絨毛尿囊膜的病變情況、尿囊液是否渾濁等。給豚鼠和家兔進行腦內(nèi)接種時，先作麻醉或人工固定，在顱前后中線旁邊 5mm平行線與動物瞳孔橫線交叉處消毒，用錐刺穿顱骨，然后用針頭刺入 4－ 10mm，接種 。 動物接種途徑和接種方法 ? 2）皮內(nèi)接種 常用于大動物。注射劑量較大時，可分點注射。 ? 3）皮下注射 豚鼠和家兔可選擇腹部及大腿內(nèi)側(cè)皮膚松弛處，小鼠可選擇尾根部或背部，碘酊消毒皮膚處，用針頭水平方向挑起皮膚，刺入 ，緩慢注入接種物 。家兔耳靜脈注射時，先固定在特制固定器上或人工固定，剃耳毛，用酒精棉球涂擦注射部位靜脈 1分鐘，使靜脈擴張，再用左手拇指及中食指抓住耳尖部，刺入針頭緩慢注射 1－ 5ml接種物。 動物接種途徑和接種方法 ? 5）腹腔接種 家兔和豚鼠先在腹股溝處刺入皮下，進針少許后再刺入腹腔注射 。 動物接種后的觀察及含毒組織的收獲 ? 動物接種后應(yīng)每天觀察，注意動物的活動、飲食、糞便與尿液及皮毛體表等情況，還應(yīng)根據(jù)接種微生物的特性及動物性別、年齡等的不同而有所側(cè)重，如體溫曲線、特征性臨床癥狀的出現(xiàn)及注射部位的特征性變化等。 、工業(yè)化大規(guī)模繁殖病原的方法 ? 大量培養(yǎng)細菌的方法 ? （ 1） 固體培養(yǎng)基表面培養(yǎng)法 此法是將溶化的肉湯瓊脂培養(yǎng)基，分裝于大扁瓶 (大型克氏瓶 )，滅菌后平放使凝固，經(jīng)培養(yǎng)觀察無污染，在無菌室接入種子液，使均勻分布于表面，平放溫室靜置培養(yǎng)，然后傾去凝集水，收集菌苔制成菌懸浮液。 ? （ 3）液體深層通氣培養(yǎng)法 使用培養(yǎng)罐（反應(yīng)缸），帶有攪拌器和通氣系統(tǒng)，或自動控制裝置，用人工控制培養(yǎng)溫度和通氣量。 工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)病毒的方法 ? （ 1） 單層轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 是在轉(zhuǎn)鼓條件下發(fā)展起來的，專用于大量生產(chǎn)細胞的一種設(shè)備，能自動調(diào)溫、調(diào)速和報警，靠一臺馬達驅(qū)動，轉(zhuǎn)瓶架分上、中、下幾層，每層可放一排 1萬 — m1的轉(zhuǎn)瓶，轉(zhuǎn)瓶是擱置在滾軸上，以每小時 9～ 15轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動。 工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)病毒的方法 ? （ 2） 培養(yǎng)罐培養(yǎng) 培養(yǎng)罐罐體結(jié)構(gòu)均為不銹鋼質(zhì)，可以自動調(diào)溫、調(diào) pH值，用無級馬達、磁攪拌、消泡、控制氧壓、自動補液、換液、自動高壓滅菌、自動計算呼吸商等。 工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)病毒的方法 ? （ 3）微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng) 微載體的直徑在60～ 250 μm ，由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。 工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)病毒的方法 ? （ 4） 生物反應(yīng)器 反應(yīng)器控制系統(tǒng)由高性能、智能化的微機控制儀及附屬功能電路和器件所組成，實現(xiàn)了空氣、氧氣、氮氣和 C02氣體與 pH值、溶氧的關(guān)聯(lián)控制，能準確控制溫度、轉(zhuǎn)速、 pH值、溶解氧濃度和液位。 滅活工藝 ? 、 滅活劑 ? （ 1） 甲醛溶液 （福爾馬林） 常用的甲醛溶液約含 37%甲醛氣體（重量計），為強還原劑，能與微生物蛋白質(zhì)的氨基酸結(jié)合，形成具有其它性質(zhì)的化合物，而擾亂微生物的代謝，適當濃度可使微生物喪失增殖力或毒力，保持其抗原性和免疫原性。必要時在甲醛滅活后加入焦亞硫酸鈉以終止反應(yīng)。常用的為BEI和 AEI。水中溶解度 37％（ V/V），能與丙酮、醚和氯仿混合。 ? （ 4）硫柳汞鈉鹽 又稱乙基汞硫代水楊酸鈉，本品為劇毒品，能溶于水和醇，在空氣中穩(wěn)定，在日光下不穩(wěn)定。 、 滅活劑 ? （ 5）苯酚 又名石炭酸，為羥基與芳烴族（苯環(huán)與稠丙環(huán)）直接連接的化合物，其中苯的一部分被酚取代。常作為細菌滅活疫苗的抑菌劑、消毒劑或滅活劑，用量為 －%。其陽離子與微生物蛋白質(zhì)帶陰電的羥基形成弱電力的化合物，防礙微生物的正常代謝，也可擾亂微生物的氧化還原作用，使電勢太高，不利于微生物的增殖。采用熱滅活方法牛副結(jié)核滅活疫苗和草魚出血病滅活疫苗。 60Co照射處理，應(yīng)根據(jù)被照射物的容量大小選擇照射物與鈷源的距離和劑量。 20世紀 30年代，用結(jié)晶紫成功地研制出豬瘟疫苗。 佐劑配制 ? 、佐劑作用 ? 對抗原的作用 佐劑吸附抗原后增加抗原的表面積，并改變活性基因的構(gòu)型，因而增強抗原的免疫原性；佐劑和抗原被巨噬細胞吞噬，對抗原加工處理，賦予較強的免疫原性，增強 T細胞和 B細胞的協(xié)同作用；延長抗原在組織內(nèi)的貯存時間，是抗原緩慢降解和緩慢釋放。 、佐劑標準 ? 無致癌或輔助致癌作用，不能誘導(dǎo)或促進腫瘤形成； ? 無毒性，純度高，注射、口服等對動物安全，無任何毒、副作用； ? 符合相關(guān)的質(zhì)量標準； ? 具有一定的吸附力； ? 能在動物體內(nèi)降解吸收，不易在組織中長期存留而誘發(fā)組織損傷； ? 不誘發(fā)自身超敏反應(yīng)及與血清抗體結(jié)合形成有害的免疫復(fù)合物； ? 不含有與動物發(fā)生交叉反應(yīng)的抗原物質(zhì)； ? 性能穩(wěn)定，佐劑抗原混合物儲存后不分解、不變質(zhì)、不產(chǎn)生有害物質(zhì)。 這類佐劑在獸用生物制品中廣泛采用， 《 規(guī)程 》 現(xiàn)有的滅活疫苗中大多數(shù)用氫氧化鋁膠作為佐劑，如牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗、偽狂犬病滅活疫苗等。 2）油佐劑 ? 早期有弗氏佐劑，以羊毛脂為乳化劑，具有親油親水性，乳化作用較好，但制出的乳劑非常粘稠。國內(nèi)廣泛選用注射白油、司本 80和吐溫80作為油佐劑。 ? 乳化劑不同、礦物油不同、乳化劑配合比例不同及乳化方法不同，均影響著乳劑的性狀和穩(wěn)定性。 、佐劑的類型 ? 3）蜂膠佐劑 蜂膠是蜜蜂采集植物分泌的樹脂，混入蜜蜂上顎腺分泌物，以及蜂蠟、花粉和其他一些有機與無機物的一種天然物質(zhì)，具有廣譜的生物活性。 、佐劑的類型 ? 4）人工合成佐劑 研究最多的屬胞壁酰二肽（ MDP）及其衍生物、海藻糖合成衍生物，已合成了多種 MDP的類似物和衍生物，這類佐劑和抗原形成油包水乳劑，接種動物具有有效的佐劑活性，但作為水溶液接種動物后，迅速排出，其佐劑活性受到限制。 TDM有多種生物學(xué)活性，抗感染和抗腫瘤。如革蘭氏陰性菌外膜脂多糖（ LPS）、分枝菌的胞壁成分、革蘭氏陽性菌的脂磷壁酸（ LTA）、蛋白毒素等。 Quil A是從皂樹皮提取的一種糖苷，純化的 Quil A能與病毒被膜蛋白或細菌和寄生蟲的外膜蛋白的疏水基結(jié)合。 、佐劑的類型 ? 7）細胞因子類佐劑 多種細胞因子是有效的免疫增強劑，能增強由病毒、細菌和寄生蟲疫苗產(chǎn)生的保護作用。 ? 8）其它佐劑 這類佐劑主要有非離子阻斷共聚物表面活性劑、核酸及其類似物佐劑和左旋咪唑等。用明礬作佐劑配苗時，按滅活的菌液量加入明礬溶液 1－ 2％，充分振蕩，然后沉淀而成。在膠體磨或乳劑缸內(nèi)配制成油包水或水包油包水疫苗。 （二）活疫苗制備技術(shù) ? 弱毒活疫苗是用人工培育的弱菌（毒）株或自然弱（無）毒菌（毒）株或異種菌（毒）株或基因工程弱毒疫苗株生產(chǎn)的，對原宿主動物無致病性或引起亞臨床感染，但能使接種動物產(chǎn)生免疫力，以抵抗由該種病原引起的疾病。弱毒疫苗具有用量少、成本低、免疫力產(chǎn)生快、免疫期長等優(yōu)點。如布魯氏菌病豬 2號株就是自然界中存在的弱毒株，已成功地用于制作活疫苗。如致弱的兔、山羊、綿羊牛傳染性胸膜肺炎菌株、布魯氏菌羊型 5號菌株、乳兔肺致弱的豬支原體肺炎疫苗株等。 ? 4） 誘變菌株 射線處理病原微生物或在體外的培養(yǎng)基中加入化學(xué)誘變劑，都能提高微生物的突變率，從而有助于