【正文】 )，流動(dòng)相僅靠重力作用自上而下緩緩流過色譜柱，流出液用人工分段收集后再進(jìn)行分析，因此柱效較低，費(fèi)時(shí)較長，近來已逐漸被各種加壓液相色譜所代替。常見的 Zorbax系列 HPLC填充柱型號(hào)見表 1． 1。各種加壓液相色譜的分離規(guī)模如下圖所示 42 （二 )根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進(jìn)行分離 各種加壓液相柱色譜的大體分離規(guī)模 43 （二 )根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進(jìn)行分離 此外，在色譜柱出口處常常配以高靈敏度的檢測器，以及自動(dòng)描記、分部收集的裝置，并用計(jì)算機(jī)進(jìn)行色譜條件的設(shè)定及數(shù)據(jù)處理。下圖為常用高壓液相裝置的模式圖。常用 Lobar柱的型號(hào)及規(guī)格可參見下表進(jìn)行選擇。無條件時(shí)也可采用高位溶劑貯液槽造成的位能差進(jìn)行。 48 （二 )根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進(jìn)行分離 7．液滴逆流色譜 (DCCC)及高速逆流色譜(HSCCC) 1970年，由 Tanimura在液 液分配色譜基礎(chǔ)上創(chuàng)建的液滴逆流色譜裝置(Droplet counter current chromatography，簡稱 DCCC)可使流動(dòng)相呈液滴形式垂直上升或下降，通過固定相的液柱，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的逆流色譜分離 (左圖 )。分離 酸堿兩性化合物時(shí)，緩沖液是很好的溶劑。 （ 2）采用等體積兩相溶劑的方式。 （二 )根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進(jìn)行分離 51 （二 )根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進(jìn)行分離 DCCC以及 HSCCC均可克服上述液相色譜中因?yàn)椴捎霉腆w載體所引起的不可逆吸附消耗、試樣變性污染及色譜峰畸形拖尾等弊病，試樣還可以定量回收，目前已廣泛用于皂苷、生物堿、酸性化合物、蛋白質(zhì)、糖類等天然化合物的分離精制工作，并取得了良好的效果。其中又以固．液吸附用得最多 ，并有 物理吸附、化學(xué)吸附及半化學(xué)吸附 之分。特點(diǎn)是無選擇性、吸附與解吸過程可逆、可快速進(jìn)行，故在實(shí)際工作中用得最廣。 55 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 1．物理吸附基本規(guī)律 —— 相似者易于吸附 固液吸附時(shí)，吸附劑、溶質(zhì)、溶劑三者統(tǒng)稱為吸附過程中的三要素。物理吸附過程一般無選擇性，但吸附強(qiáng)弱及先后順序都大體遵循 “ 相似者易于吸附 ” 的經(jīng)驗(yàn)規(guī)律。 (2)溶劑極性越弱，則吸附劑對(duì)溶質(zhì)將表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸附能力。 (3)溶質(zhì)即使被硅膠、氧化鋁吸附，但一旦加人極性較強(qiáng)的溶劑時(shí)，又可被后者置換洗脫下來。溶劑極性降低，則活性炭對(duì)溶質(zhì)的吸附能力也隨之降低。 58 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 2．極性及其強(qiáng)弱判斷 極性強(qiáng)弱是支配物理吸附過程的主要因素。 59 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 (1)官能團(tuán)的極性強(qiáng)弱按下表順序排列： 官能團(tuán)的極性 60 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 (2)化合物的極性則由分子中所含官能團(tuán)的種類、數(shù)目及排列方式等綜合因素所決定。高級(jí)脂肪酸，如硬脂酸，雖也含有如羧基這樣的強(qiáng)極性基團(tuán)，但因分子的主體乃由長鏈烴基所組成，故極性依然很弱。 61 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 次苷 D(COOH)C(CH2 OH)A(CHO)B(CH3) 苷 A苷 B次苷 D次苷 C次苷 A次苷 B單乙酰次苷 B 62 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 極性強(qiáng)弱順序決定著化合物在硅膠上的吸附行為及柱色譜的洗脫規(guī)律 酸性、堿性及兩性有機(jī)化合物的極性強(qiáng)弱及吸附行為主要由其存在狀態(tài) (游離型或離解型 )所決定，并受溶劑 pH的影響。因此實(shí)踐中常可通過改變?nèi)軇?pH以改變酸性、堿性及兩性化合物的存在狀態(tài)，進(jìn)而影響其吸附或色譜行為達(dá)到分離精制的目的。 常用溶劑的介電常數(shù)及其極性排列如表 15所示： 64 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 65 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 3．簡單吸附法進(jìn)行物質(zhì)的濃縮與精制 簡單吸附，如在結(jié)晶及重結(jié)晶過程中加入活性炭進(jìn)行的脫色、脫臭等操作，在物質(zhì)精制過程中應(yīng)用很廣。一般須根據(jù)預(yù)試結(jié)果先判斷色素的類型，再?zèng)Q定選用什么吸附劑處理為宜。例如，報(bào)道有人曾采用活性炭吸附法成功地從一葉蔌水浸液中提取一葉蔌堿。濾集吸堿炭末，干燥后與苯回流，回收苯液即得一葉蔌堿。有關(guān)注意事項(xiàng)如下： 67 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 (1)硅膠、氧化鋁吸附柱色譜過程中，吸附劑的用量一般為試樣量的30～ 60倍。據(jù)此可選用適當(dāng)規(guī)格的色譜管，實(shí)驗(yàn)室中常用色譜管的規(guī)格如下所示，其高度與直徑比 (h/d)約為(15： 1)～ (20： 1)。通常以 100目左右為宜，如采用加壓柱色譜，還可以采用更細(xì)的顆粒，甚至直接采用薄層色譜用規(guī)格，其分離效果可以大大提高 . 68 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 (2)硅膠、氧化鋁吸附柱色譜，應(yīng)盡可能選用極性小的溶劑裝柱和溶解試樣，以利試樣在吸附劑柱上形成狹窄的原始譜帶。 69 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 (3)洗脫用溶劑的極性宜逐步增加，但跳躍不能太大。一般，混合溶劑中強(qiáng)極性溶劑的影響比較突出，故不可隨意將極性差別很大的兩種溶劑組合在一起使用。 70 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 (4)為避免發(fā)生化學(xué)吸附，酸性物質(zhì)宜用硅膠、堿性物質(zhì)則宜用氧化鋁進(jìn)行分離。通常在分離酸性 (或堿性 )物質(zhì)時(shí)，洗脫溶劑中分別加入適量醋酸 (或氨、吡啶、二乙胺 )，常可收到防止拖尾、促進(jìn)分離的效果。但因 TLC用吸附劑的表面積一般為柱色譜用的二倍左右，故一般 TLC展開時(shí)使組分比值達(dá)到 ～ 用為柱色譜分離該相應(yīng)組分的最佳溶劑系統(tǒng)。聚酰胺吸附物質(zhì)的原理可用圖 。 76 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 ② 成鍵位置對(duì)吸附力也有影響。 77 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 ③ 分子中芳香化程度高者，則吸附性增強(qiáng)；反之，則減弱。但吸附因?yàn)槭窃谌芤褐羞M(jìn)行，故障劑也會(huì)參加吸附劑表面的爭奪，或通過改變聚酰胺對(duì)溶質(zhì)的氫鍵結(jié)合能力而影響吸附過程。故在聚酰胺柱色譜分離時(shí)，通常用水裝柱，試樣也盡可能做成水溶液上柱以利聚酰胺對(duì)溶質(zhì)的充分吸附，隨后用不同濃度的含水醇洗脫，并不斷提高醇的濃度，逐步增強(qiáng)從柱上洗脫物質(zhì)的能力。此外，水溶液中加入堿或酸均可破壞聚酰胺與溶質(zhì)之間的氫鍵締合，也有很強(qiáng)的洗脫能力，可用于聚酰胺的精制及再生處理。 79 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 綜上分析，各種溶劑在聚酰胺柱上的洗脫能力由弱至強(qiáng)，可大致排列成下列順序： 水 甲醇 丙酮 氫氧化鈉水溶液 甲酰胺 二甲基甲酰胺 尿素水溶液 80 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 (2)聚酰胺色譜的應(yīng)用：如上所述，聚酰胺對(duì)一般酚類、黃酮類化合物的吸附是可逆的 (鞣質(zhì)例外 )，分離效果好，加以吸附容量又大，故聚酰胺色譜特別適合于該類化合物的制備分離。另外因?yàn)閷?duì)鞣質(zhì)的吸附特強(qiáng)，近乎不可逆，故用于植物粗提取物的脫鞣處理特別適宜。 81 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 6．大孔吸附樹脂 大孔吸附樹脂一般為白色球形顆粒，通常分為非極性和極性兩類。對(duì)有機(jī)物選擇性好，不受無機(jī)鹽等離子和低分子化合物的影響。 分子篩性 是由于其本身多孔性結(jié)構(gòu)的性質(zhì)所決定。 ② 對(duì)有機(jī)物選擇性較好 。 ④ 再生處理方便 。 ② 篩性原理：是由大孔吸附樹脂本身的多孔性所決定的 。一般非極性化合物在水中易被非極性樹脂吸附，極性樹脂則易在水中吸附極性物質(zhì)。據(jù)此經(jīng)常用大孔吸附樹脂將中藥的化學(xué)成分和糖分離。物質(zhì)在溶劑中的溶解度大，樹脂對(duì)此物質(zhì)的吸附力就小，反之就大。化合物的性質(zhì)也是影響吸附的重要因素。分子量小、極性小的化合物與非極性大孔吸附樹脂吸附作用強(qiáng)。 86 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 影響大孔吸附樹脂分離效果的因素： ① 化合物分子極性大?。阂话銇碚f ， 大孔樹脂的色譜行為具有反相的性質(zhì) 。 ② 分子體積大小：在一定條件下 ， 化合物體積越大 ， 吸附力越強(qiáng) 。在多糖、黃酮、三萜類化合物的分離方面都有很好的應(yīng)用實(shí)例。 大孔吸附樹脂的預(yù)處理：以乙醇濕法裝柱，繼續(xù)用乙醇在柱上流動(dòng)清洗，不時(shí)檢查流出的乙醇，當(dāng)流出的乙醇液與水混合不呈現(xiàn)白色乳濁現(xiàn)象即可，然后以大量的蒸餾水洗去乙醇。根據(jù)吸附作用強(qiáng)弱選用不同的洗脫液或不同濃度的同一溶劑。對(duì)于中等極性的大孔樹脂和極性較大的化合物來說，則選用極性較大的溶劑為宜。 89 (三 )根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 (5)應(yīng)用實(shí)例：甜葉菊苷的提取分離 90 (四 )根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離 天然有機(jī)化合物分子大小各異，分子量從幾十到幾百萬，故也可據(jù)此進(jìn)行分離。前兩者系利用半透膜的膜孔或凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩濾過作用；超濾法則利用因分子大小不同引起的擴(kuò)散速度的差別；至于超速離心法則系利用溶質(zhì)在超速離心作用下具有不同的沉降性或浮游性?？墒悄z濾過法不然，它可用于分離分子量 1 000以下的化合物。其中所用載體，如葡聚糖凝膠，是在水中不溶、但可膨脹的球形顆粒，具有三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。試樣混合物中各個(gè)成分因分子大小各異，滲入至凝膠顆粒內(nèi)部的程度也不盡相同，故在經(jīng)歷一段時(shí)間流動(dòng)并達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，即按分子由大到小順序先后流出并得到分離 (圖 ） 93 (四 )根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離 1．凝膠濾過法分離物質(zhì)的原理 凝膠色譜簡單原理圖 1．待分離的混合物在色譜床表面 2．試樣進(jìn)入色譜床，小分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子隨溶液流動(dòng) 3．大分子物質(zhì)行程短，流出色譜床，小分子物質(zhì)仍在緩慢移動(dòng) 94 (四 )根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離 以上情況可用下式作進(jìn)一步說明。 Ve=KlK2lgM 因 K K2均為常數(shù)，故洗脫體積 (Ve)取決于分子量 (M)的大小。由此進(jìn)一步說明了凝膠濾過的洗脫規(guī)律。 95 (四 )根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離 2．凝膠的種類與性質(zhì) 商品凝膠的種類很多，常用的有 葡聚糖凝膠 (sephadex G)以及 羥丙基葡聚糖凝膠 (sephadex LH20)。 其部分結(jié)構(gòu)如下圖所示。加入的交聯(lián)劑數(shù)量越多即交聯(lián)度越高，網(wǎng)孔越緊密，孔徑越小，吸水膨脹也越??；交聯(lián)度越低，則網(wǎng)孔越稀疏，吸水后膨脹也越大。以 sephadexG25為例， G為凝膠 (Gel)，后附數(shù)字 =吸水量 1 O，故 G25示該葡聚糖凝膠吸水量為 ml/g。此時(shí)，葡聚糖凝膠分子中的葡萄糖部分將與羥丙基結(jié)合成下列醚鍵形式： 100 (四 )根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離 與 sephadex G比較， sephadex LH20分子中 OH基總數(shù)雖無改變，但碳原子所占比例卻相對(duì)增加了。下表為 sephadex LH20在不同溶劑中濕潤膨脹后得到的柱床體積及保留溶劑數(shù)量。其中， d1去甲烏藥堿 (d1demethylcoclaurine)的分離實(shí)例可以代表 sephadex LH20用于物質(zhì)分離的一般操作過程。用過的 sephadex LH20可以反復(fù)再生使用，而且柱子的洗脫過程往往就是柱子的再生過程。含水醇洗 (醇的濃度逐步遞增 )_醇洗，最后泡在醇中貯于磨口瓶中備用。 103 (四 )根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離 此外，商品凝膠還有丙烯酰胺凝膠 (BioGel P)、瓊脂糖凝膠 (sepharose BioGel A)以及結(jié)合了不同離子交換基團(tuán)的葡聚糖凝膠衍生物，如羧甲基交聯(lián)葡聚糖凝膠 (CMsephadex)。 104 (五 )根據(jù)物質(zhì)離解程度不同進(jìn)行分離 天然有機(jī)化合物中，具有酸性、堿性及兩性基團(tuán)的分子，在水中多呈離解狀態(tài)，據(jù)此可用離子交換法或電泳技術(shù)進(jìn)行分離。 105 (五 )根據(jù)物質(zhì)離解程度不同進(jìn)行分離 1．離子交換法分離物質(zhì)的原理： 離子交換法系以離子交換樹脂作為固定相，用水或含水溶劑裝柱。 106 (五 )根據(jù)物質(zhì)離解程度不同進(jìn)行分離 2．離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)及性質(zhì) 離子交換樹脂外觀均為球形顆粒，不溶于水，但可在水中膨脹。交聯(lián)度越大，則網(wǎng)孔越小，質(zhì)地越緊密，在水中越不易膨脹；交聯(lián)度越小，則網(wǎng)孔越大，質(zhì)地疏松，在水中易于膨脹，常見交聯(lián)度等級(jí)如表 19所示。 108 (五 )根據(jù)物質(zhì)離解程度不同進(jìn)行分離 109 (五 )根據(jù)物質(zhì)離解程度不同進(jìn)行分離 (2)離子交換基團(tuán)：上列結(jié)構(gòu)式中為磺酸基 (一S03H)。以強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂1 7(上海樹脂廠 732型 )為例，它對(duì)分子量 89． 09的丙氨酸來說， 1 g上述陽離子交換樹脂理論上能交換 mg的丙氨酸。 112 (五 )根據(jù)物質(zhì)離解程度不同進(jìn)行分離 離子交換樹脂法分離物質(zhì)的模型