nk殺傷實(shí)驗(yàn)ppt課件-在線瀏覽
2025-06-22 18:18本頁(yè)面
【正文】 物原液直接加入 96孔板內(nèi)。 C時(shí)比重為 +，淋巴細(xì)胞比重為，而粒細(xì)胞和紅細(xì)胞比重為 。 Gravity FicollHypaque 177。 取 2ml淋巴細(xì)胞分離液加入 10ml離心管中，將稀釋的血 液用滴管沿離心管壁層加于分離液上（血：分離液 =1 4： 1），保持兩者的清楚界面。 用平口滴管小心吸出界面上白色霧狀的淋巴細(xì)胞層，用 Hanks液洗二次，離心分別為第一次 2022 rpm/10分； 第二次 1500 rpm/10分。 細(xì)胞活力測(cè)定：取少許混勻細(xì)胞加入苔盼藍(lán)染液（細(xì) 胞 :染液 =1:1），低倍鏡下觀察，不著色者為活細(xì)胞， 著色者為死細(xì)胞。 細(xì)胞計(jì)數(shù)：混勻細(xì)胞，用白細(xì)胞稀釋液做一定稀釋后，灌 于細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)算池內(nèi)，低倍鏡下計(jì)數(shù)，按下式計(jì)算每 ml細(xì)胞數(shù)： 細(xì)胞數(shù) /ml = 4個(gè)大方格細(xì)胞數(shù) 247。 注意事項(xiàng) 分離細(xì)胞時(shí)嚴(yán)格保持血液 /細(xì)胞懸液與分離液兩 者的清楚界面，切勿形成氣泡。 實(shí)驗(yàn)原理 四甲基偶氮唑鹽 (MTT) 是一種黃色的染料。該顆粒溶解后，其液體的吸光度值（ A）與活細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞代謝活性呈正相關(guān)。由于死細(xì)胞中不含琥珀酸脫氫酶，因此加入 MTT 不會(huì)產(chǎn)生甲臜。 肝素防凝外周血常規(guī)分離淋巴細(xì)胞（見(jiàn)附：淋巴細(xì)胞分離 技術(shù)）， Hanks液洗三次，計(jì)數(shù)及活力測(cè)定后，用 1640培 液調(diào)細(xì)胞數(shù)為 106 /ml。 將效靶比 =50: 25:1的淋巴細(xì)胞（效）、 K562細(xì)胞（靶） 加入 96孔圓底板：實(shí)驗(yàn)組分別加入各效靶比的效、靶細(xì)胞 各 100μl/孔；同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞孔及效應(yīng)細(xì)胞孔作為對(duì)照孔。另加儀器調(diào)零孔 1640培液 200μl/ 孔， 1孔。 置 37℃ 、 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4小時(shí)。 3000rpm/10min，離心，棄上清，每孔加 DMSO 150 μl，充分混勻， 10分鐘內(nèi)酶標(biāo)儀檢測(cè) 570 nm波長(zhǎng) A值。 人外周血 NK細(xì)胞殺傷活性正常參考值： 效靶比 =50:1，男性 + %；女 性 + % 注意事項(xiàng) 效靶細(xì)胞的計(jì)數(shù)及加樣要準(zhǔn)確 。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。 （一）基本原理 基本原理 先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性，將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原進(jìn)行反應(yīng)，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離成分，然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行抗原或抗體的定性或定量檢測(cè)。將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本（含相應(yīng)抗體）與之結(jié)合，溫育洗滌后，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體（酶標(biāo)抗抗體）和底物顯色進(jìn)行測(cè)定（圖 1） 。將已知抗體吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本（含相應(yīng)抗原）與之結(jié)合，溫育洗滌后，加入酶標(biāo)抗體和底物顯色進(jìn)行測(cè)定（圖 2）。以測(cè)抗原為例，將特異抗體吸附于固相載體，加入待測(cè)抗原和酶標(biāo)已知抗原，使兩者競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，經(jīng)過(guò)洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測(cè)抗原含量呈負(fù)相關(guān)，即待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原顏色反應(yīng)的差數(shù)是待測(cè)抗原的含量（圖3）。生物素 親合素系統(tǒng)（ BAS）是在 ELISA中應(yīng)用的常見(jiàn)技術(shù)（ BASELISA），其中 ABS ELISA法更為常用，其基本原理為，固相抗體 +待測(cè)抗原 +生物素化抗體 +親合素 酶標(biāo)生物素復(fù)合物 +底物顯色。親和素是一種糖蛋白，分子量 60,000，每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成。用化學(xué)方法制成的衍生物素 羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質(zhì)和糖等多種類(lèi)型的大小分子形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物，標(biāo)記方法頗為簡(jiǎn)便。由于一個(gè)親和素可與 4個(gè)生物素分子結(jié)合，因此如把 ABS與 ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素 生物素（ LAB）法和橋聯(lián)親和素 生物素（ ABC）法兩種類(lèi)型。 在 LAB中，固相生物素先與不標(biāo)記的親和素反應(yīng)，然后再加酶標(biāo)記的生物素以進(jìn)一步提高敏感度。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素則無(wú)此缺點(diǎn)，在 ELISA應(yīng)用中有替代前者的趨勢(shì)。 人白細(xì)胞介素 2（ IL
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