【正文】 溫度大于 74℃ ，不適于 Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。引物 3’端出現(xiàn) 3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或 CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為 A的錯(cuò)配效率明顯高于其他 3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的 3’端使用堿基 A。 PCR反應(yīng)體系 — 引物設(shè)計(jì)注意事項(xiàng) ?5’端序列對(duì) PCR影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。 ?簡(jiǎn)并引物應(yīng)選用簡(jiǎn)并程度低的密碼子 , 例如選用只有一種密碼子的 Met, 3’端應(yīng)不存在簡(jiǎn)并性。 ?兩引物間最好不存在 4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性 ?引物序列的 GC含量一般為 4060%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)，因?yàn)?GC含量決定了 DNA雙鏈的解鏈溫度（ Tm）。 PCR反應(yīng)體系 — 引物設(shè)計(jì)注意事項(xiàng) ? 引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的 Tm值在 72℃ 左右可使復(fù)性條件最佳。 ?△ G值是指 DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。引物的 3’端的 △ G值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā) DNA聚合反應(yīng)。 ?對(duì)引物的修飾一般是在 5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入 PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。引物過(guò)多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體 , 過(guò)低則降低產(chǎn)量。 引物濃度計(jì)算 PCR反應(yīng)體系 — dNTP原液可配成 510mmol/L并分裝 ,20℃ 貯存。理論上 4 種 dNTP各 20μmol/L,足以在 100μl反應(yīng)中合成 DNA。 PCR反應(yīng)體系 — 4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP) Mg2+濃度對(duì) Taq DNA聚合酶影響很大 ,它可影響酶的活性和真實(shí)性 ,影響引物退火和解鏈溫度 , 影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。對(duì)于一種新的 PCR反應(yīng) ,可以用 + 進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn) ,選出最適的 Mg2+濃度。 PCR反應(yīng)體系 — Mg2+ 就模板 DNA而言 ,影響 PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度 .一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為 102 105 個(gè)拷貝 ,對(duì)于單拷貝基因 ,這需要 DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大腸桿菌 DNA；擴(kuò)增多拷貝序列時(shí) ,用量更少；靈敏的 PCR可從一個(gè)細(xì)胞 ,一根頭發(fā) ,一個(gè)孢子或一個(gè)精子提取的 DNA中分析目的序列；模板量過(guò)多則可能增加非特異性產(chǎn)物 .DNA中的雜質(zhì)也會(huì)影響 PCR的效率。 SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白， SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶 K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與 DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。 ?PCR反應(yīng)體系 — 模板的提取方法 Taq DNA聚合酶活性半衰期為 ℃ 130min,95℃ 40min, 97℃ DNA聚合酶 ,這些酶的活性在高溫下活性可維持更長(zhǎng)時(shí)間 .Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為 74℃ 下 ,30min,摻入 10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量 . ?PCR反應(yīng)體系 — Taq DNA聚合酶 ? Taq DNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率 ,一般 PCR中出錯(cuò)率為 2 104 核苷酸 /每輪循環(huán) ,在利用 PCR克隆和進(jìn)行序列分析時(shí)尤應(yīng)注意 .在100μl PCR反應(yīng)中 , Taq DNA聚合酶就足以進(jìn)行 30輪循環(huán) .所用的酶量可根據(jù) DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p .酶量過(guò)多會(huì)使產(chǎn)物非特異性增加 ,過(guò)少則使產(chǎn)量降低 .反應(yīng)結(jié)束后 ,如果需要利用這些產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn) ,需要預(yù)先滅活 Taq DNA聚合酶 , 滅活 Taq DNA聚合酶的方法有： (1) PCR產(chǎn)物經(jīng)酚 :氯仿抽提 ,乙醇沉淀。 (3) 99100℃ 加熱 10min. 目前已有直接純化 PCR產(chǎn)物的 Kit可用。Cl (20℃ 下 ), 50mmol/L KCl和適當(dāng)濃度的 Mg2+ . Tris PCR反應(yīng)體系 — PCR反應(yīng)緩沖液 PCR反應(yīng)參數(shù) ?在第一輪循環(huán)前 ,在 94℃ 下變性 510min非常重要 ,它可使模板 DNA完全解鏈 ,然后加入 Taq DNA聚合酶 (hot start),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對(duì)的引物與模板復(fù)合物所造成的錯(cuò)誤。 ?對(duì)于富含 GC的序列 ,可適當(dāng)提高變性溫度 .但變性溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。一般當(dāng)引物中 GC含量高 ,長(zhǎng)度長(zhǎng)并與模板完全配對(duì)時(shí) , 應(yīng)提高退火溫度。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并 ,只用兩種溫度 (例如用 60℃ 和 94℃ )完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán) , 既省時(shí)間又提高了特異性。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加 .但對(duì)很低濃度的目的序列 , 則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。 延 伸 當(dāng)其它參數(shù)確定之后 , 循環(huán)次數(shù)主要取決于 DNA濃度。循環(huán)次數(shù)過(guò)多 ,會(huì)使 PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。 循環(huán)次數(shù) ?擴(kuò)增產(chǎn)物的量可用下列公式表示 :C＝ C0 (1+P)n 。 在擴(kuò)增后期 ,由于產(chǎn)物積累 ,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線(xiàn) ,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升 ,這稱(chēng)為平臺(tái)效應(yīng)。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。 (2) 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）： 6～ 10%聚 丙烯酰胺凝膠 電泳分離效果較瓊脂糖好 ? 酶切分析 ? 分子雜交 ? 測(cè)序 ?功能 ?引物設(shè)計(jì) ?限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)分析 ?DNA基序 (motif)查找 ?同源性分析 常規(guī) PCR技術(shù)及幾類(lèi) PCR新技術(shù) ?熱啟動(dòng) PCR ?Touchdown PCR ?RTPCR ?簡(jiǎn)并引物 PCR ?巢氏 PCR ?反向 PCR ?不對(duì)稱(chēng) PCR ?原位 PCR ?連接酶鏈反應(yīng) ?RACEPCR ?AFLP ?免疫 PCR(immunoPCR) 熱啟動(dòng) PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高 PCR特異性最重要的方法之一。因此，在進(jìn)行 PCR反應(yīng)配制過(guò)程中，以及在熱循環(huán)剛開(kāi)始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如 sitedirected突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng) PCR尤為有效。這種方法簡(jiǎn)單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。包括延緩加入 Taq DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動(dòng)方法十分煩瑣，尤其是對(duì)高通量應(yīng)用。在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來(lái)并混合在一起。 Platinum DNA聚合酶對(duì)于自動(dòng)熱啟動(dòng) PCR來(lái)說(shuō)方便高效。此酶在常溫下活性被封閉，要在 94℃ － 95℃ 下加熱數(shù)分鐘才能夠恢復(fù)酶活性。使用 PlatinumTaq DNA聚合酶，在 94℃ 進(jìn)行 2分鐘就可以恢復(fù) 90％的 Taq DNA聚合酶活性。即 選定一個(gè)溫度范圍，如 50— 35 ℃ ，每 降 12 ℃ 進(jìn)行 12個(gè) 循環(huán)，然后在 50度下進(jìn)行 15個(gè) 循環(huán)。 選擇初始復(fù)性溫度的原則：起始復(fù)性溫度應(yīng)該比引物的Tm值高出 510度，然后每個(gè)循環(huán)遞減 12度 Touchdow