【正文】 酒精用于蘇木素染色前由高濃度向低濃度逐漸下降處理切片 ,洗脫用于脫蠟的二甲苯。梯度酒精(95%,80%)使水分逐漸進(jìn)入切片，以免引起細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的人工改變。否則切片組織不能顯示清晰的細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)。 HE染色中分化和藍(lán)化的作用： :蘇木素染色后 ,水洗去未結(jié)合在切片中的染液 ,但細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合過多的染液和細(xì)胞漿中吸附過多的染料必須用分化液(1%鹽酸酒精）脫去，以保證核與漿的染色分明。但不能過度。所以分化后用水洗去酸而中止分化，也可用稀氨水或溫水變藍(lán)。 第三節(jié) 組織切片特殊染色 (Masson三色染色 ) 為了顯示組織或細(xì)胞中的正常結(jié)構(gòu)或病理過程中出現(xiàn)的異常物質(zhì)、病變、病原體等，需要選用相應(yīng)的顯示這些成分的染色方法進(jìn)行染色，這些是常規(guī)染色所不能的。如細(xì)胞中的黑色素或含鐵血黃素的區(qū)別，用特殊染色即可做到。 這三種纖維廣泛分布于身體各處 ， 常見于器官與器官之間 ， 組織與組織之間以及細(xì)胞和細(xì)胞之間 ， 這些纖維具有支持 、 連接 、營養(yǎng) 、 防御 、 保護(hù)和創(chuàng)傷修復(fù)等功能 ， 在 中有時(shí)難以區(qū)別 ， 特別是在某些病理改變時(shí) ， 則要借助于特染鑒別 。 顯示膠原纖維的方法很多，最常用的是Masson三色染色和 。 Masson三色染色技術(shù)操作 Masson復(fù)合染色液：酸性復(fù)紅、麗春紅、橘黃 G、醋酸 亮綠染色液（可用苯胺藍(lán)替換）：亮綠、醋酸 染色過程： 2. 蘇木素染 5分鐘 , 水洗 3. 鹽酸酒精分化 , 水洗 4. 染于麗春紅復(fù)紅液 5分鐘 , 水洗 5. 磷鉬酸水溶液分化 5分鐘 ,水洗 6. 染于亮綠 25分鐘 、透明、封固 結(jié)果判定 : 膠原纖維呈綠色或藍(lán)色，肌纖維、纖維素、紅細(xì)胞呈紅色，胞核呈藍(lán)黑色。若想學(xué)好免疫組織化學(xué)，必須先了解與之相關(guān)的免疫學(xué)基礎(chǔ)。 凡是能作抗原、半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、酶、激素磷脂、多糖、受體及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體在組織、細(xì)胞內(nèi)將其用免疫細(xì)胞化學(xué)手段檢出和研究。 免疫細(xì)胞化學(xué)采用各種有效方法最大限度保存細(xì)胞和組織內(nèi)待檢物的抗原性，采用多種增敏方法，使用高度敏感的和高親和力的抗體，保證檢出細(xì)胞內(nèi)超微量的抗原分子，用顯微鏡和電子顯微鏡觀察結(jié)果，因此它是在細(xì)胞、分子水平或基因水平的檢測技術(shù)。 、定性又可定量 免疫組化技術(shù)用于組織或細(xì)胞成分定性、定位及定量的研究 有關(guān)的免疫學(xué)理論 一、抗原、抗體的概念及抗原抗體的關(guān)系 抗原 (Antigen)凡能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并能與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)稱為抗原。抗原可以是可溶性物質(zhì)（如病毒和蛋白質(zhì)）或微粒（細(xì)菌或組織細(xì)胞）。 抗體 (Antibody)是機(jī)體受抗原刺激后，在體液中出現(xiàn)的一種能與相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng)的球蛋白，稱免疫球蛋白 (Immunoglobulin, Ig)。人類免疫球蛋白有五類即 IgG, IgM, IgA, IgE,IgD。 抗原與抗體的關(guān)系 抗原是引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要外因，決定免疫反應(yīng)的特異性，機(jī)體與抗原物質(zhì)的斗爭過程中為加速循環(huán)和排除抗原而產(chǎn)生的抗體、致敏淋巴細(xì)胞等物質(zhì)，是機(jī)體排除異體物質(zhì)的保護(hù)性反應(yīng)。 二、免疫細(xì)胞化學(xué)的分類 根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可分為免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)；免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)；免疫鐵蛋白技術(shù)；免疫金 — 銀細(xì)胞化學(xué)技術(shù)；親和免疫細(xì)胞化學(xué)技 術(shù)；免疫電子顯微鏡技術(shù)等。目前國內(nèi)外市場各種特異性抗體日益增多，可直接應(yīng)用市售產(chǎn)品。 三、免疫染色 可在細(xì)胞涂片或組織切片上進(jìn)行免疫染 色。在 此基礎(chǔ)上發(fā)展出間接法，多層法，雙標(biāo)記法 等各種方法。此方法稱熒光抗原（抗體）法。 直接法 : 用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成特異性熒光抗體。常用于腎穿和病原體的檢查。先用特異性抗體（一抗）與組織標(biāo)本反應(yīng)，再用間接熒光抗體（二抗）與結(jié)合在抗原的抗體結(jié)合，形成 抗原－抗體－熒光抗體的復(fù)合體。 檢測操作流程 (直接法） 在制備或購得高質(zhì)量的熒光抗體的前提下，可按直接法進(jìn)行如下的操作： 、涂片經(jīng)丙酮固定 10min后進(jìn)入PBS充分洗滌；石蠟切片脫蠟入水后， %胰蛋白酶消化 40min左右入 PBS洗滌。 3 3min。 ，水溶性封固劑封片。隨著時(shí)間的推移及觀察次數(shù)的增加，熒光逐漸減弱。 壞死和凋亡的比較：綠色細(xì)胞為凋亡；紅色細(xì)胞為壞死 第三節(jié) 免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（ immunoenzyme cytochemistry technique ） 是在抗原抗體特異性反應(yīng)的前提下，借助酶細(xì)胞化學(xué)原理探測細(xì)胞內(nèi)抗原或抗體及其存在部位的一門技術(shù)。 方法：按照酶是否預(yù)先與抗體結(jié)合在一起可分為 酶標(biāo)抗體法 和 非標(biāo)記抗體酶法 常用的標(biāo)記酶依次為：辣根過氧化物酶 （ horseradish peroxidase， HRP）、堿性磷酸酶（ alkaline phosphatase， ALP）、葡萄糖氧化酶（ glucose oxidase， GOD）。 免疫酶直接法 免疫酶間接法 （一）直接法： 用酶（如 HRP）標(biāo)記的特異性抗體（一抗）直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原結(jié)合，形成抗原 — 抗體 — HRP復(fù)合物，最后用酶底物 DAB— H2O2（二胺基聯(lián)苯胺）呈現(xiàn)棕色或深棕色產(chǎn)物。 （二）間接法： 先用未標(biāo)記的特異性抗體（一抗）與標(biāo)本中相應(yīng)的抗原反應(yīng)，再 用酶標(biāo)記的 “ 抗抗體 ” （二抗 ） 與已形成抗原抗體復(fù)合物的第一抗體分子反應(yīng)，然后再進(jìn)行顯色反應(yīng)。一般免疫組化多采用此法。 酶底物顯色劑 DAB BCIPNBT AEC New Fuchsin 卡巴唑 （三）過氧化物酶抗過氧化物酶復(fù)合物法 （ peroxidase— antiperoxidase， PAP） 此種方法屬 非標(biāo)記抗體酶法（抗酶抗體 法） 。另外，血清中非特異性抗體也可被酶標(biāo)記，增加非特異性背景染色。 此方法先用酶（ HRP）制成高效價(jià) 特異性抗體 ，再將酶與 抗酶抗體 形成復(fù)合物 （ PAP復(fù)合物） 。可以避免酶標(biāo)過程中酶和抗體的減弱。此種具有高度親和能力的物質(zhì)是卵白素 — 生物素。卵白素（ avidin）稱抗生物素，具有 4個(gè)與維生素 H親和力極高的結(jié)合點(diǎn)，他們之