基因的克隆ppt課件-在線瀏覽
2025-06-20 22:02本頁面
【正文】 cDNA 人工合成 PCR擴(kuò)增特定的目的基因片段 基因克隆的載體 ? 載體滿足的幾個(gè)要求： （ 3～ 10Kb）能進(jìn)行復(fù)制且具有高度拷貝數(shù) ，便于所要 DNA片段能夠連接、插入載體，酶切位點(diǎn)應(yīng)該在載體復(fù)制子意外適當(dāng)?shù)奈恢谩? ，以及能接納盡可能大的外源性 DNA片段。 ，不污染環(huán)境。 pBR322克隆 DNA片段的程序 質(zhì)粒作為基因克隆載體應(yīng)注意： ? 質(zhì)粒的選擇：質(zhì)粒應(yīng)具備完成實(shí)驗(yàn)?zāi)康乃璧幕窘Y(jié)構(gòu)，如啟動(dòng)子、ＳＤ順序、終止信號(hào)、分泌信號(hào)等。 ? 酶切 DNA片段末端的考慮：酶切后形成的 DNA片段末端有黏性末端和平末端。 ? 載體的自身環(huán)化：有時(shí)發(fā)生酶切過的線性載體 DNA在酶的（ T4DNA）催化下，線性載體 DNA兩黏性末端會(huì)重新連接。也可以通過磷酸酯酶處理線性 載體 DNA。 ? ti質(zhì)粒和上步中的重組子來轉(zhuǎn)化根瘤土壤農(nóng)桿菌。 ? 的野生型 Ti，可隨根瘤土壤農(nóng)桿菌感染植物而進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)可隨 TDNA一起整合到植物宿主細(xì)胞的染色體中。 目的基因與載體的連接 ? 黏性末端和平末端： a：沿著中軸線切口（即沿著 DNA雙鏈中對(duì)應(yīng)的磷酸二酯鍵）切開，得到的就是兩個(gè)平末端。 例如 :EcoRI限制性內(nèi)切酶就可以識(shí)別 G/AATTC的 DNA序列，然后在 G和 A間切開，得到的就是兩個(gè)黏性末端。 黏性末端和平末端： 黏性末端的連接： 單酶切黏性末端的連接 雙酶切黏性末端的連接 平末端的連接（轉(zhuǎn)化成黏性末端） 由于連接平末端 DNA片段時(shí)，所需底物濃度高，且連接效率低。 圖為人工接頭連接法 利用適配子來重組 DNA分子 連接產(chǎn)物導(dǎo)入受體細(xì)胞（細(xì)菌） ? 氯化鈣法將其導(dǎo)入受體細(xì)胞： 利用氯化鈣和熱休克使受體菌成為感受態(tài)細(xì)胞，促進(jìn)外源 DNA進(jìn)入。經(jīng)此處理后的細(xì)胞“容易”接受外源基因，一般叫做感受態(tài)細(xì)胞。 連接
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