基因工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用-在線瀏覽
2025-03-05 15:14本頁面
【正文】 而只能降解外源的 DNA。 在識別序列雙鏈 DNA兩條鏈的對稱軸兩側(cè)同時從 3’端切斷磷酸二酯鍵，形成 3’羥基 端 2～ 5個核苷酸突出 單鏈黏性末端 。 （ 1）底物 DNA制備物的純度 蛋白質(zhì)、十二烷基硫酸鈉（ SDS）、乙二胺四乙酸（ EDTA）、酚、氯仿、乙醇及高濃度的鹽離子等污染物都會抑制限制酶的活性。 dcm甲基化酶 ：催化 DNA分子中 5’CCAGG3’或 5’CCTGG3’序列中的 胞嘧啶 C5位置的甲基化。 在用限制酶酶解同樣分子質(zhì)量的 DNA時 ， 環(huán)狀雙螺旋 DNA所需酶量為線性 DNA所需酶量的 10～ 20倍 。 TrisHCl的作用在于使反應(yīng)液的pH值穩(wěn)定于酶活性所要求的最佳范圍內(nèi)，而后三者均有穩(wěn)定酶的作用。反應(yīng)溫度高于或低于其最適溫度，酶的活力均會下降。 （ 1）在特異位點(diǎn)上切割 DNA，產(chǎn)生特異的限制酶切割的DNA片段。 限制酶圖譜 （ restriction map） :指一系列限制酶的特異識別序列在 DNA鏈上的出現(xiàn)頻率和它們之間的相對位置。 基因工程中，將某種生物的全部基因組的遺傳信息，貯存在可以長期保存的穩(wěn)定的重組體中，以備需要時能夠隨時應(yīng)用它分離所需要的目的基因，這種保存基因組遺傳信息的材料，稱為 基因文庫 （ gene library） （ 4）用限制酶切出相同的黏性末端，以便重組 DNA。 依賴于 RNA的 DNA聚合酶 （即逆轉(zhuǎn)錄酶） 優(yōu)先以 RNA為模板，也可以 DNA為模板。 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 （簡稱末端轉(zhuǎn)移酶） 不以 DNA或 RNA為模板，而只是將核苷酸加到已有 DNA分子的末端。 （ 2）不能起始合成新的 DNA鏈，要有引物 3’羥基的存在。 （ 4）催化 DNA合成的方向是 5’→3 ’ 。 具有三種活性 ：① 5’→3 ’DNA聚合酶活性，以單鏈 DNA為模板，以帶 3’自由羥基的 DNA片段為引物；② 5’→3 ’外切核酸酶活性，從 5’端既降解雙鏈 DNA，也降解 RNADNA雜交體中的 RNA鏈（ RNA酶 H活性）；③ 3’→5 ’外切核酸酶活性，底物為帶 3’自由羥基的雙鏈 DNA或單鏈 DNA。 DNA聚合酶 Ⅰ 大片段 （ Klenow片段 ） 一條分子質(zhì)量為 76KDa的多肽鏈 ， 一般由大腸桿菌 DNA聚合酶 I全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶水解獲得 ， 也可通過克隆技術(shù)獲得 。② 3’→5 ’外切核酸酶活性，底物為帶 3’自由羥基的雙鏈 DNA或單鏈 DNA。 分子質(zhì)量為 65KDa， 是一種非常耐熱的依賴于 DNA的 DNA聚合酶 。 主要用于 ：①對 DNA進(jìn)行測序。 （ 依賴于 RNA的 DNA聚合酶 ） 常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種 ：一種來自禽成髓細(xì)胞瘤病毒 （ AMV） ， 由兩條多肽鏈組成 ， 分子質(zhì)量為 170KDa。 具有兩種活性 ：① 5’→3 ’DNA聚合酶活性，以 RNA或者DNA為模板，以帶 3’自由羥基的 RNA或 DNA片段為引物。 逆轉(zhuǎn)錄酶無 3’→5 ’外切核酸酶活性，即無校對功能，其催化的聚合反應(yīng)容易出錯。 具有一種活性 ：即末端轉(zhuǎn)移酶活性，在二價陽離子存在下，其催化 dNTP加于 DNA分子的 3’羥基端。②以 32P標(biāo)記的一種 dNTP或一種 rNTP來標(biāo)記 DNA片段的 3’端。 具有一種活性 ：即催化 DNA的 5’磷酸基與 3’羥基之間形成磷酸二酯鍵 。 主要用于 ：①連接帶匹配黏性末端的 DNA分子。 來源于大腸桿菌及牛小腸 。 具 磷酸酶活性 ， 催化去除 5’磷酸的反應(yīng) 。 主要用于 ：①在用 32P標(biāo)記 5’末端前，去除 DNA或 RNA分子的 5’磷酸。 三、基因工程的載體 載體 （ vector）：攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具。在插入外源基因后，仍然保持著穩(wěn)定的復(fù)制狀態(tài)和遺傳特性。 （ 3） DNA序列中有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)，最好是單一酶切位點(diǎn)，并位于 DNA復(fù)制的非必需區(qū)內(nèi)，可以在這些位點(diǎn)上插入外源 DNA，但不影響載體自身 DNA的復(fù)制。 載體的報(bào)告基因 （標(biāo)記基因）：基因工程中利用載體上引入的一些具有特殊標(biāo)志意義的基因，可用來證明載體已經(jīng)進(jìn)入宿主細(xì)胞，并可用來將含有目的基因的宿主細(xì)胞從其他細(xì)胞中識別區(qū)分甚至挑選出來，這種具有標(biāo)志意義的基因稱為報(bào)告基因（ reporter gene）或標(biāo)記基因。 按照介導(dǎo)的作用目的，可將基因工程載體主要分為 克隆載體 和 表達(dá)載體 。（例如，細(xì)菌質(zhì)粒載體、 λ 噬菌體載體、柯氏質(zhì)粒載體） 表達(dá)載體 ：有一個受體生物細(xì)胞所要求的包括啟動子序列在內(nèi)的調(diào)控系統(tǒng)，能使外源基因在受體生物細(xì)胞中進(jìn)行功能表達(dá)。 （一）大腸桿菌載體 質(zhì)粒 :指細(xì)菌等生物細(xì)胞內(nèi)一類獨(dú)立于染色體外而能自我復(fù)制的遺傳物質(zhì) 。 （ 1）質(zhì)粒的生物學(xué)特性 一般為 雙鏈 的 共價閉合環(huán)狀 DNA（ ccc DNA），質(zhì)粒分子的長度一般為 1～ 200 kb。 （ 2）質(zhì)粒的分類 根據(jù)復(fù)制控制類型：一般可將大腸桿菌質(zhì)粒分為 嚴(yán)緊型復(fù)制控制質(zhì)粒 和 松弛型復(fù)制控制質(zhì)粒 。如果宿主蛋白質(zhì)的合成終止，質(zhì)粒與宿主染色體的復(fù)制也停止。 松弛型復(fù)制控制質(zhì)粒 :復(fù)制與宿主染色體的復(fù)制不同步，其與 DNA聚合酶 Ⅰ 的活性有關(guān)，而與蛋白質(zhì)的合成無關(guān)。每個宿主細(xì)胞中的質(zhì)?？截悢?shù)可達(dá) 10～ 200個。 ② 能插入 、 運(yùn)載一定大小的外源基因 。 ④ 在與外源基因構(gòu)建重組質(zhì)粒后具有 轉(zhuǎn)化功能 。 ⑥ 容易控制 ， 安全可靠 。 （ 4）質(zhì)粒 pBR322 組成 ①氨芐青霉素抗性基因（ ampr） ②四環(huán)素抗性基因（ tetr） ③ DNA復(fù)制起始點(diǎn)（ ori） 優(yōu)點(diǎn) ①分子質(zhì)量小。 ③較高的拷貝數(shù)。 ③氨芐青霉素抗性基因（ ampr），但其核苷酸序列有變化，不含原來內(nèi)切限制酶的單位識別位點(diǎn)。 優(yōu)點(diǎn) ①更小的分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)。 ③有多克隆區(qū)位點(diǎn)。 大多數(shù)噬菌體顆粒由呈 20面體的頭部及尾部構(gòu)成 ， 例如 ， λ 噬菌體；還有一些噬菌體顆粒為線狀體形 ， 例如 ， M13。 噬菌體顆粒的外殼是蛋白質(zhì) ， 內(nèi)部是核酸 。 （ 2） λ 噬菌體載體 λ 噬菌體顆粒由頭與尾兩部分組成。 λDNA 為一長度約 kb的線狀雙鏈 DNA分子，可以分為三個區(qū)
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