【正文】 胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物本身有一種自然純化的特性。不同類型細(xì)胞的物理性狀可能互不相同，這些差異正是部分或完全地分離純化細(xì)胞的依據(jù)之一。 細(xì)胞分離純化中 最常利用 的物理性狀是 細(xì)胞的體積 （大?。?、 密度 和 表面電荷 。不同類型細(xì)胞往往具有不同的體積和密度，可以采用沉降技術(shù)將其分離開來。 應(yīng)用沉降技術(shù)，使之 沉降的 細(xì)胞的密度 應(yīng)該比介質(zhì)大，而使之 漂浮的 細(xì)胞的密度 則應(yīng)比介質(zhì)小。 選擇 密度梯度形成介質(zhì) 的 一般原則 是： ①所形成溶液的密度應(yīng)包括所需要的密度范圍； ②形成的溶液黏度較低； ③具有某些性質(zhì)如折射率，據(jù)此可測定它的濃度（或密度）； ④不損傷細(xì)胞或不改變細(xì)胞的生物學(xué)特性； ⑤離心分離后易于除去； ⑥不妨礙分離組分的分析。 （ 2） 聚蔗糖（ polysucrose） 是一種合成的蔗糖聚合物， 商品名 叫 Ficoll,常用的是： Mr400 000 Pa,名為 Ficoll 400。 Ficoll 400是目前常用的細(xì)胞分離介質(zhì)之一，商品含量為 40％（ w／ V），也可用 Ficoll干粉來配制。 國外常用商品 Isopaque或稱 Triasil (sodium metrizoate)和Hypaque (sodium diatrizoate），與 Ficoll配制的溶液商品名為FicollIsopaque(Triosil)或 FicollHypaque，泛影酸鹽價(jià)格較貴。 （ 4） 硅膠顆粒 用 聚乙烯毗咯烷酮 （ polyvinylpyrolidone, PVP)包被 硅膠顆粒 ， 商品名為 Percoll。 因此， Percoll是一種很優(yōu)良的分離介質(zhì)，是現(xiàn)在用于分離多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的 最常用介質(zhì)之一 。 將細(xì)胞懸液加于一種高密度介質(zhì)上，應(yīng)用低速離心，密度大于介質(zhì)的細(xì)胞通過介質(zhì)而沉淀于管底，而密度低于介質(zhì)的細(xì)胞則滯留于介質(zhì)之上，體積較大的細(xì)胞沉降較快，體積較小的細(xì)胞沉降較慢，從而將具有不同密度和大小的細(xì)胞分離開來。 一步密度梯度法常用的分離介質(zhì)是： FicollHypaque,也可用 Percoll,動(dòng)物血清 ,BSA等。 在 等密度連續(xù)梯度 分離中，細(xì)胞在強(qiáng)離心力的作用下，通過密度逐漸增高的介質(zhì)沉降，當(dāng)其到達(dá)某一沉降距離，細(xì)胞的密度恰好等于梯度介質(zhì)的密度，因此沉降速度為 0。 因此，等密度梯度離心法分離細(xì)胞僅僅依賴于細(xì)胞的密度。 非連續(xù) 密度梯度離心法 分離細(xì)胞的原理與 連續(xù) 密度梯度離心法 是相同的，但細(xì)胞集中在介質(zhì)和介質(zhì)之間的界面上。 雖然細(xì)胞體積的大小可影響建立平衡的速度，但不影響達(dá)到平衡時(shí)細(xì)胞在梯度上所處的位置。因?yàn)榻⑵胶獾乃俣扰c介質(zhì)的黏度成反比，故采用 Percoll等低黏度介質(zhì)所制備的密度梯度離心分離細(xì)胞，可在低離心力、短時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡。 細(xì)胞在單位重力下通過低密度介質(zhì)（約 g/ml）沉降，或在低離心力（通常為 100 g）作用下通過密度梯度層而沉降，此種細(xì)胞分離方法即速度沉降。 離心淘析（ centrifugal elutriation）分離技術(shù)是通過含細(xì)胞介質(zhì)溶液的流力和浮力與細(xì)胞所受離心力之間相互作用而分離細(xì)胞的一種技術(shù)。細(xì)胞在電場中的泳動(dòng)速度與其所帶電荷密度有關(guān)。 電泳分離細(xì)胞需要特殊的儀器設(shè)備。某些儀器僅用于分析，有些則既可用于分析，也可用于制備。 采用自由流動(dòng)電泳儀可以進(jìn)行細(xì)胞的連續(xù)分離，目前多用的儀器是 EIPhor VaP細(xì)胞電泳儀。 優(yōu)缺點(diǎn)：細(xì)胞電泳分離技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是所分離的細(xì)胞完整無損，活性較高，保持原來的生物學(xué)特性，可用于許多方面的研究。 密度梯度電泳分離法是用聚蔗糖或聚蔗糖／蔗糖制成密度梯度進(jìn)行電泳分離細(xì)胞的技術(shù)，樣品經(jīng)分離后，不同的細(xì)胞群體在此梯度上形成穩(wěn)定的區(qū)帶。 密度梯度電泳技術(shù)分離細(xì)胞方法復(fù)雜，設(shè)備價(jià)格昂貴，現(xiàn)在應(yīng)用并不廣泛。 根據(jù)這種差異，可用下列方法 分離 或 消除 某些類型的細(xì)胞。這種將黏附較快的細(xì)袍與黏附較慢（或無黏附能力）的細(xì)胞分開并分別收集的處理過程就稱為 差速黏附處理 。另外，像 巨噬細(xì)胞 之類的具有強(qiáng)黏附能力的細(xì)胞也常借此方法而與其它黏附能力較差的細(xì)胞相分離。葡聚糖 G10凝膠具有極小的微孔，常用于分離生物大分子，但也可用來分離細(xì)胞。 用羰基鐵粉處理，能有效地去除異質(zhì)性細(xì)胞懸液中 具有黏附能力的細(xì)胞。 此法 通常用于 去除免疫細(xì)胞懸液中的 單核／巨噬細(xì)胞 。 尼龍毛 (nylon wool)就是聚酰胺纖維。 其 基本原理 是： B淋巴細(xì)胞和單核／巨噬細(xì)胞易黏附于尼龍毛表面，當(dāng)白細(xì)胞懸液通過尼龍毛柱時(shí)， B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及單核／巨噬細(xì)胞將黏附于柱上，而無黏附能力的 T細(xì)胞則通過柱子，收集流出的細(xì)胞即獲 T淋巴細(xì)胞。 根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志的不同，利用相應(yīng)的抗體特別是單克隆抗體和配體，已經(jīng)建立了多種基于親和原理的細(xì)胞分離純化方法。 ： 免疫溶解法也稱免疫消除法。利用這一原理，將待消除細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志的抗體和補(bǔ)體加入細(xì)胞懸液或細(xì)胞培養(yǎng)物中，使抗體及補(bǔ)體作用于具相應(yīng)抗原的細(xì)胞并溶解之。 ： 凝集素 (lectin)是一類以兩價(jià)或多價(jià)與糖結(jié)合的非酶非抗體蛋白質(zhì)，能凝集具有一個(gè)以上相應(yīng)互補(bǔ)性糖類的細(xì)胞或其它物質(zhì)。幾乎所有的細(xì)胞都存在一到幾種凝集素的受體，而不同類型細(xì)胞往往具有不同凝集素受體。 原則上講，所有細(xì)胞，包括細(xì)菌細(xì)胞及單細(xì)胞原生動(dòng)物，都可以采用不同的凝集素來進(jìn)行分離純化。 ： 流式細(xì)胞儀（ flow cytometer, FCM）是一種將 流體噴射技術(shù)、激光技術(shù)、空氣計(jì)數(shù)、 γ 射線能譜術(shù) 及 電子計(jì)算機(jī) 等技術(shù)與 顯微熒光光度計(jì) 密切結(jié)合的儀器，流式細(xì)胞術(shù)（ flow cytometry）就是應(yīng)用 FCM檢測、分析生物顆粒（包括細(xì)胞）的物理和／或化學(xué)特性或借這些特性進(jìn)行分離純化的技術(shù)。 目前，流式細(xì)胞術(shù)主要用于細(xì)胞的定性、定量研究。 磁性微珠是一種人工合成的、含金屬的小顆粒，由三部分組成： 核心是金屬小顆粒， 核心的外層 均勻包裹一層高分子材料（如聚苯乙烯、聚氯乙烯等）， 最外層 是功能基團(tuán)，如氨基（ — NH2）、羧基（ — COOH2）、羥基（ — OH）等，以便與生物大分子偶聯(lián)。磁珠與抗體的結(jié)合可能只與抗體蛋白的通性和磁珠的特性有關(guān)，而與不同個(gè)體的個(gè)性關(guān)系不大，因此磁珠對(duì)抗體蛋白的結(jié)合具有普遍意義，從而保證其廣泛的應(yīng)用。目前，這種處理方法主要是針對(duì)植塊內(nèi)成纖維細(xì)胞與目的細(xì)胞向外遷移的速度有較大差別而應(yīng)用的。但 缺點(diǎn) 是純化周期長，細(xì)胞產(chǎn)量低，細(xì)胞純度難以保證。常用的有阿糖胞苷（ arabinosylcytosine, AraC）、氟尿嘧啶（ fluorouracil, FU）等。繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間，不能進(jìn)行分裂活動(dòng)的可分裂細(xì)胞將逐漸死亡。 體外培養(yǎng)的基本原理與技術(shù) 一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長條件 二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程 三、體外培養(yǎng)物的生長生物學(xué) 四、細(xì)胞分離與純化 五、細(xì)胞系（株）、細(xì)胞克隆 六、培養(yǎng)物的觀察檢測方法 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 從有機(jī)體取得組織、細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，原代培養(yǎng)物中一般都包含多種細(xì)胞成分。 建立細(xì)胞系、細(xì)胞株和細(xì)胞克隆以及細(xì)胞周期同步化處理就是不同層次上的細(xì)胞純化過程。但僅僅經(jīng)過傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)物的細(xì)胞組成還不能達(dá)到完全單一。 （一）細(xì)胞系（株）的建立與鑒定 基本概念 將從有機(jī)體得到的細(xì)胞在體外進(jìn)行第一次培養(yǎng)，稱之為 原代培養(yǎng) ，也叫 初代培養(yǎng) 。所以， 細(xì)胞系 就是指從原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代培養(yǎng)后得來的一群不均一的細(xì)胞，可以長期連續(xù)傳代。 細(xì)胞系雖然并不強(qiáng)調(diào)單一的細(xì)胞類型，可以包含來自所取組織中的多種細(xì)胞成分，但一般認(rèn)為應(yīng)以某種細(xì)胞為主，即 主類細(xì)