基因工程育種微生物遺傳育種-在線瀏覽
2025-02-26 13:22本頁面
【正文】 體外人工剪切組合，并和載體（質(zhì)粒、噬菌體、病毒） DNA連接，然后轉入微生物或細胞內(nèi)，進行擴增，并使轉入的基因在細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生所需要的蛋白質(zhì)。 2 奠定基因工程的三項關鍵技術 ? DNA的特異切割 Smith 和 Nathans 獲 1978年諾貝爾醫(yī)學獎 ? DNA的分子克隆 Berg（ 1972）將猴病毒 SV40 DNA與 λ噬菌體基因融合，成功構建重組 DNA； Cohen 和 Boyer （ 1973）將質(zhì)粒 pSC101與 R的tetrkmr基因融合，并將重組 DNA轉化 ，首次實現(xiàn)了 DNA的分子克隆。 核糖核酸酶 (RNase)與脫氧核糖核酸酶 (DNase) 核酸外切酶： exonuclease 核酸內(nèi)切酶： endonuclease 5 寄主控制的限制與修飾作用 （ 1）寄主控制的限制作用 (Restriction) 作用：破壞外源 DNA，使之迅速降解 機制：限制性核酸內(nèi)切酶，識別特定的堿基序列并進 行切割 （ 2）寄主控制的修飾作用 (Modification) 作用：保護自身的 DNA，使之不受限制 機制：甲基化酶，催化 S腺苷甲硫氨酸的甲基轉移到 限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。 ? 輔助條件： DTT、牛血清蛋白。 ? 其它：甘油濃度等可以改變對序列的識別。 HpaⅡ 與 MspI: CCGG 廣義：來源于不同物種但能 識別相同 DNA序列的限制性內(nèi)切酶， 切割 位點 可以相同也可以不同 異功酶（ neoschizomer）： SmaI和 XmaI，它們均識別 CCCGGG，但前者切后產(chǎn)生鈍末端，后者切后產(chǎn)生粘性末端。 體外 DNA連接 ? 連接具有互補粘性末端的 DNA片段 ? 連接具有平末端的 DNA片段 ? 先在 DNA片段末端加上人工接頭，使其形成粘性末端，再行連接 15 連接用酶 （ 1） T4 DNA連接酶： ? 催化反應需要 Mg+2, ATP ? 催化粘性末端連接，效率較高 ? 催化平末端連接 （ 2）大腸桿菌連接酶 ? 催化反應需要 NAD+ ? 只能催化粘性末端的連接 16 減少載體自身連接的方法： 脫磷酸； 雙酶切 17 三、反轉錄酶 (reverse transcriptase) 催化以 mRNA為模板的 cDNA的合成 cDNA（ plementary DNA） ： 互補于 mRNA的 DNA片段 內(nèi)含子 外顯子 DNA ↓轉錄 前體 mRNA ↓修飾 成熟 mRNA 18 Reverse transcription 19 四、末端轉移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase) 催化將脫氧核苷酸連接至 DNA分子末端的3’OH上 ? 向 3’單鏈末端上連接： Mg+2 ? 向平末端上連接： Co+2 五、 Taq DNA聚合酶 ? 來源：棲熱水生菌 Thermus aquaticus 20 第二節(jié) 基因的克隆載體 (cloning vector) 克隆載體 ： 以繁殖 DNA片段為目的的載體 克隆載體的基本要求 ? 在細胞中能進行自主復制，為松弛型 。 ? 容易進入宿主細胞，進入效率越高越好，并且容易從宿主細胞中分離純化出來，以便于重組操作 。 同一不親和群： 不能共存于同一細胞中 不同的不親和群： 能共存于同一細胞中 26 (4)質(zhì)
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