【正文】 二磷酸 磷酸二羥丙酮 +D甘油醛 3磷酸 果糖二磷酸醛縮酶 D甘油醛 3磷酸醛 酮 異構(gòu)酶 D甘油醛 3磷酸 磷酸二羥丙酮 丙糖磷酸異構(gòu)酶 L谷氨酸：氨連接酶（生成 ADP） ATP+L谷氨酸 +NH3 ADP+Pi+L谷氨酰胺 谷氨酸 氨連接酶 酶的分類與命名舉例 目 錄 （二）推薦名稱簡(jiǎn)便而常用 由于系統(tǒng)名稱較煩瑣，國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)還同時(shí)為每一個(gè)酶從常用的習(xí)慣名稱中挑選出一個(gè)推薦名稱（ remended name） 系統(tǒng)名稱 L乳酸： NAD+氧化還原酶 推薦名稱 乳酸脫氫酶 目 錄 五、同工酶催化相同的化學(xué)反應(yīng) （一）同工酶是催化相同化學(xué)反應(yīng)而結(jié)構(gòu)不同的一組酶 ? 定義 :同工酶 (isoenzyme)是指催化相同的化學(xué)反應(yīng) ， 而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu) 、 理化性質(zhì)乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶 。 目 錄 H H H H H H H M H H M M H M M M M M M M LDH1 (H4) LDH2 (H3M) LDH3 (H2M2) LDH4 (HM3) LDH5 (M4) 乳酸脫氫酶的同工酶 * 舉例： 乳酸脫氫酶 (LDH1～ LDH5) 目 錄 （二）同工酶在生物體中的表達(dá)分布具有時(shí)空特異性 同工酶 存在于同一種屬的不同個(gè)體，同一個(gè)體的不同組織、同一細(xì)胞的不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以及同一組織、細(xì)胞的不同發(fā)育階段。 心肌梗死和肝病病人血清 LDH同工酶譜的變化 1 酶活性 心肌梗死酶譜 正常酶譜 肝病酶譜 2 3 4 5 目 錄 第二節(jié) 酶的工作原理 Mechanism of Enzymatic Reactions 目 錄 一 、酶具有與一般催化劑相似的工作原理 （一）酶與一般催化劑一樣能降低反應(yīng)的活化能 1．活化能是化學(xué)反應(yīng)的能障 活化能 ： 指在一定溫度下一摩爾底物（ substrate）從低自由能的初始態(tài)轉(zhuǎn)變成能量較高的過(guò)渡態(tài)所需要的自由能，即過(guò)渡態(tài)中間產(chǎn)物比基態(tài)底物高出的那部分能量。 酶比一般催化劑更有效地降低反應(yīng)的活化能 。 反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)自由能的變化僅取決于底物與產(chǎn)物的自由能之差 。 目 錄 二、酶具有不同于一般催化劑的顯著特點(diǎn) 酶的催化效率通常比無(wú)催化劑時(shí)的自發(fā)反應(yīng)高108~1020倍，比一般無(wú)機(jī)催化劑高 107~1013倍。 （二）酶對(duì)底物具有高度的特異性或?qū)Ｒ恍? 目 錄 有的酶僅對(duì)一種特定結(jié)構(gòu)的底物起催化作用 ， 產(chǎn)生具有特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物 。 脲酶僅水解尿素，對(duì)甲基尿素則無(wú)反應(yīng)。 脂肪酶不僅水解脂肪，也可水解簡(jiǎn)單的酯。 目 錄 各種蛋白酶對(duì)肽鍵的專一性 目 錄 人體內(nèi)有多種蛋白激酶，它們均催化底物蛋白質(zhì) 絲氨酸（或蘇氨酸）殘基上羥基的磷酸化 蛋白激酶 共有序列 蛋白激酶 A XR(R/K)X(S/T)X 蛋白激酶 C X(R/K13,X02)(S/T)(X02,R/K13)X 蛋白激酶 G X(R/K)23X(S/T)X Ca2+/鈣調(diào)素蛋白激酶 Ⅱ XRXX(S/T)X 目 錄 3. 有些酶對(duì)其底物表現(xiàn)出立體異構(gòu)專一性 酶對(duì)空間構(gòu)型所具有的特異性要求稱為空間異構(gòu)特異性 （ stereospecificity） 延胡索酸酶僅對(duì)延胡索酸 (反丁烯二酸 )起催化作用 ， 將其加水生成蘋(píng)果酸 ， 對(duì)順丁烯二酸則無(wú)作用 目 錄 HCH3C C O O HO HHCH3C O HC O O HABC ABCL 乳 酸 D 乳 酸乳 酸 脫 氫 酶乳酸脫氫酶僅催化 L乳酸脫氫生成丙酮酸，而對(duì) D乳酸無(wú)作用。 酶的活性中心 (active center) （一）酶分子上的必需基團(tuán)與酶的活性密切相關(guān) 目 錄 溶菌酶的活性中心 目 錄 酶的活性中心由許多必需基團(tuán)組成 必需基團(tuán) (essential group) 酶分子中氨基酸殘基側(cè)鏈的化學(xué)基團(tuán)中 ，與酶活性密切相關(guān)的化學(xué)基團(tuán) 。 ? 活性中心外的必需基團(tuán) 底 物 活性中心以外的必需基團(tuán) 結(jié)合基團(tuán) 催化基團(tuán) 活性中心 目 錄 目 錄 組成酶活性中心的必需基團(tuán)在 一級(jí)結(jié)構(gòu)上可能相距很遠(yuǎn) ，但在形成 三級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)相互接近 ，形成具有三維結(jié)構(gòu)的區(qū)域，且多是酶分子中的裂隙或凹陷所形成的疏水口袋。 這一過(guò)程稱為酶 底物結(jié)合的誘導(dǎo)契合假說(shuō) 。 結(jié)合能可以抵消一部分活化能 ， 是酶反應(yīng)降低活化能的主要能量來(lái)源 。 目 錄 3．鄰近效應(yīng)和定向排列有利于底物形成過(guò)渡態(tài) 鄰近效應(yīng) （ proximity effect） 和 定向排列（ orientation arrange） 將分子間的反應(yīng)變成類似分子內(nèi)的反應(yīng) ， 使反應(yīng)速率顯著提高 。 酶的活性中心多位于其分子內(nèi)部的疏水 “ 口袋 ”中 ， 酶反應(yīng)在酶分子內(nèi)部的疏水環(huán)境中進(jìn)行 。 4. 表面效應(yīng)有利于底物和酶的接觸與結(jié)合 目 錄 （二）酶對(duì)底物呈現(xiàn)多元催化 酶是兩性解離的蛋白質(zhì) ， 酶活性中心上有些基團(tuán)是質(zhì)子供體 （ 酸 ） ， 有些是質(zhì)子接受體 （ 堿 ） 。 質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)都包含一般酶 堿催化反應(yīng) 目 錄 氨基酸殘基 酸（質(zhì)子供體） 堿（質(zhì)子接受體） 谷氨酸、天冬氨酸 R?COOH R?COO? 賴氨酸、精氨酸 半胱氨酸 R?SH R?S? 組氨酸 絲氨酸 R?OH R?O? 酪氨酸 R N H H H + R NH 2 .. CH NH HN C CH R + CH N： HN C CH R OH R O R 酶分子中具有酸 堿催化作用的基團(tuán) 目 錄 酶可與底物形成瞬時(shí)共價(jià)鍵 很多酶在催化過(guò)程中，與底物形成瞬時(shí)共價(jià)鍵，底物與酶形成共價(jià)鍵后被激活，并很容易進(jìn)一步水解形成產(chǎn)物和游離的酶。 A?B + E： ??? A?E + B H2O A?E ??? A + E： + B 目 錄 酶舉例 親核基團(tuán) 共價(jià)結(jié)合中間產(chǎn)物 絲氨酸蛋白酶 絲氨酸 ?OH ?；? 巰基酶 半胱氨酸 ?SH ?；? ATP酶 天冬氨酸 ?COO? 磷酰基酶 含吡哆醛的酶 賴氨酸 ?NH2 Schiff堿 磷酸甘油酸變位酶 組氨酸 磷?；? 谷氨酰胺合成酶 酪氨酸 ?OH 腺嘌呤酶 酶的親核基團(tuán)與底物共價(jià)結(jié)合 目 錄 酶可通過(guò)親核催化或親電子催化加速反應(yīng) 酶活性中心有的催化基團(tuán)屬于親核基團(tuán) ， 可以提供電子給帶有部分正電荷的過(guò)渡態(tài)底物 ， 形成瞬間共價(jià)鍵 。 親電子催化 （ electrophilic catalysis） 可使酶活性中心的陽(yáng)離子親電子基團(tuán)與富含電子的底物形成共價(jià)鍵 。 ? 影響因素包括有 酶濃度、底物濃度、 pH、溫度、抑制劑、激活劑等。 目 錄 I. 單底物 、 單產(chǎn)物反應(yīng)； II. 酶促 反應(yīng)速率 （ velocity， V） 一般在規(guī)定的反應(yīng)條件下 ， 用單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量來(lái)表示 ； III. 反應(yīng)速率取其初速率 ， 即底物的消耗量很?。?一般在 5﹪ 以內(nèi) ） 時(shí)的反應(yīng)速率； IV. 底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度 。 酶促反應(yīng)速率可用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來(lái)表示。 目 錄 酶的活性 : 以 國(guó)際單位 （ international unit, IU） 表示 。 目 錄 催量 （ Katal） 1IU＝ 10－ 9 Kat 1催量是指在特定條件下，每秒鐘將 1mol底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物所需的酶量 比活性 （ specific activity）：比較酶的純度 比活性單位是每 mg蛋白質(zhì)所含酶的國(guó)際單位數(shù)， 其單位是 IU mg 蛋白 ?1 目 錄 （二）酶促反應(yīng)初速率是反應(yīng)剛剛開(kāi)始時(shí)測(cè)得的反應(yīng)速率 酶促反應(yīng)初速率是指反應(yīng)剛剛開(kāi)始，各種影響因素尚未發(fā)揮作用時(shí)的酶促反應(yīng)速率，即反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線為直線部分時(shí)的反應(yīng)速率。這類測(cè)定方法稱為 直接測(cè)定法 （ direct assay） 。 目 錄 有些酶促反應(yīng)的底物和產(chǎn)物不能直接進(jìn)行檢測(cè) ，必須增加一些輔助試劑來(lái)達(dá)到檢測(cè)的目的 ， 這種方法稱為 間接測(cè)定法 （ indirect assay） 2．間接測(cè)定法利用非酶輔助反應(yīng)對(duì)底物或產(chǎn)物量的變化進(jìn)行間接檢測(cè) 目 錄 3．酶偶聯(lián)測(cè)定法是間接反映初始反應(yīng)的底物或產(chǎn)物量的變化量 許多酶促反應(yīng)的底物和產(chǎn)物雖然不能直接檢測(cè) ， 但可以與另外的酶反應(yīng)相偶聯(lián) ， 偶聯(lián)的酶以第一個(gè)酶的產(chǎn)物為底物 ， 或以此類推 ， 以最后的酶反應(yīng)產(chǎn)物可以直接檢測(cè)為目的 。 當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí) 反應(yīng)速率與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)。 [S] V Vmax 目 錄 當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度 酶被底物所飽和，反應(yīng)速率不再增加，達(dá)最大速率；反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)。 [S]： 底物濃度 V： 不同 [S]時(shí)的反應(yīng)速率 Vmax： 最大反應(yīng)速率 (maximum velocity) Ｋ m： 米氏常數(shù) (Michaelis constant) Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ ── 目 錄 米 曼氏方程式推導(dǎo)基于兩個(gè)假設(shè)： E與 S形成 ES復(fù)合物的反應(yīng)是快速平衡反應(yīng)，而 ES分解為 E及 P的反應(yīng)為慢反應(yīng)，反應(yīng)速率取決于慢反應(yīng) 。 目 錄 2．米 曼氏方程的推導(dǎo)過(guò)程引入了穩(wěn)態(tài)概念 穩(wěn)態(tài)： 是指 ES的生成速率與分解速率相等，即 [ES]恒定。 2 ＝ Km + [S] Vmax Vmax[S] Vmax V [S] Km Vmax/2 （三）動(dòng)力學(xué)參數(shù)可用來(lái)比較酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)性質(zhì) 1． Km值等于即刻反應(yīng)速率達(dá)到 Vmax一半時(shí)的底物濃度 目 錄 2． Km是酶的特征性常數(shù) 在酶的結(jié)構(gòu) 、 溶液 pH、 溫度等條件不變的情 況下 ， 酶促反應(yīng)底物的 Km不因反應(yīng)中酶濃度的改 變而不同。 Km的范圍多在 106～ 102mol/L之間。即相當(dāng)于 ES分解為E + S 的解離常數(shù)（ dissociation constant, Ks）。 Km越大，表示酶對(duì)底物的親和力越小； Km越小，表示酶對(duì)底物的親和力越大。 即 Vmax = k3 [Et]。 kcat也稱為酶的轉(zhuǎn)換數(shù) (turnover number)，單位是 s?1 。 S) 。 .這種被滲透控制的碰撞速率(diffusioncontrolled rate of encounter， DCRE)的上限是 108? L/(mol kcat/Km越接近此數(shù)據(jù) ， 酶的催化效率越高 。 S) ] 乙酰膽堿酯酶 ? 108 碳酸酐酶 ? 107 過(guò)氧化氫酶 4 ? 107 巴豆酸酶 ? 108 延胡索酸酶 ? 108 磷酸丙糖異構(gòu)酶 ? 108 ?內(nèi)酰胺酶 1 ? 108 超氧化物歧化酶 7 ? 109 一些 kcat/Km值接近 DCRE的酶 目 錄 （四）采用作圖法可求得酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù) 1．林 貝氏作圖法是求得 Vmax和 Km的最常用方法 林 貝氏方程式（ LineweaverBurk equation） 將米氏方程式兩邊取倒數(shù)，并加以整理，則得出米氏方程式的雙倒數(shù)形式 ： V 1 = K m V m a x [ S ] 1 + V m a x 1 目 錄 直線在 縱軸的截距 等于 1/Vmax，而在 橫軸上的截距為 ?1/Km 目 錄 2．其他一些作圖法也可較準(zhǔn)確地求得 Vmax和 Km 海涅斯 沃爾弗作圖法（ HanesWolff plot） 雙倒數(shù)方程式兩邊同時(shí)乘以 [S] [ S ] V = K m V m a x [ S ] + V m a x 1 目 錄 直線的 斜率 等于 1/