【正文】 來(lái)說(shuō)都是可及的，降解為均相反應(yīng)，因而起始反應(yīng)速度較非均相快。因而選取一定濃度的弱酸，使殼聚糖既可以溶解又不大量形成 RNH3+，就可以實(shí)現(xiàn)降解迅速、降解產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量低的目標(biāo)。整體來(lái)說(shuō)，殼聚糖的過(guò)氧化氫氧化降解是一個(gè)吸熱反應(yīng)，升高溫度有利于降解反應(yīng)，但是隨著溫度的升高，產(chǎn)物的顏色也逐漸加深。這可能是 氧化過(guò)度，糖環(huán)斷裂所致。 另外，反應(yīng)時(shí)間、過(guò)氧化氫用量、反應(yīng)介質(zhì)及弱酸的濃度等都可對(duì)降解產(chǎn)物的分子量、色澤以及產(chǎn)率等產(chǎn)生影響。通過(guò)對(duì)正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析 得出制備較好的水溶性殼聚糖的反應(yīng)條件：反應(yīng)介質(zhì)為 2%的乙酸溶液，過(guò)氧化氫用量比 R 為 ，反應(yīng)溫度為 80℃ ，反應(yīng)時(shí)間為 2h。 過(guò)氧化氫單獨(dú)使用時(shí)電離產(chǎn)生活性自由基的過(guò)程較慢，氧化效果不好。采用 NaC1O/H2O2 為混合氧化劑，以協(xié)同氧化方式對(duì)殼聚糖進(jìn)行氧化降解，可得到不同相對(duì)分子質(zhì)量大小的低聚糖。 在紫外光照射下，過(guò)氧化氫氧化降解殼聚糖可制得相對(duì)分子質(zhì)量為 萬(wàn)左右的水溶性殼聚糖。 黃金鳳等人 [16]在異相體系的條件下，采用磷鎢酸作為催化劑協(xié)同雙氧水進(jìn)行降解反應(yīng)，得出反應(yīng)的最佳條件為 :H2O2 濃度為 ，反應(yīng)溫度為 90℃ ，反應(yīng)時(shí)間為 20min，催化劑與殼聚糖質(zhì)量比為 。 用低濃度的過(guò)氧化氫降解 部分脫乙酰化的甲殼素和殼聚糖，發(fā)現(xiàn)平均相對(duì)分子質(zhì)量的降低符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，過(guò)氧化氫降解反應(yīng)較微波降解和酶水解快。殼聚糖經(jīng)過(guò)氧化氫降解后，結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯變化，且隨殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量的降低，其穩(wěn)定性增強(qiáng)。此法是將殼聚糖與 NaBO3水溶液進(jìn)行非均相的降解反應(yīng)，氧化斷鍵發(fā)生在 β(1,4)糖苷鍵上。該法的最大優(yōu)勢(shì)在于降解反應(yīng)前后殼聚糖的自由氨基含量不發(fā)生 任何的變化，殼聚糖環(huán)結(jié)構(gòu)保持完整。 氧化降解存在的主要問(wèn)題是在降解過(guò)程中引入了各種反應(yīng)試劑，會(huì)產(chǎn)生有色副產(chǎn)物，從而增加了控制降解副反應(yīng)及降解產(chǎn)物分離純化的難度。因此，采用殼聚糖先與金屬離子配位后 再降解的方法，可制備相對(duì)分子質(zhì)量分布較窄的低聚殼聚糖。 另外，人們已采用化學(xué)合成法合成特殊結(jié)構(gòu)的低聚殼聚糖。 物理方法 物理方法降解殼聚糖包括熱降解、輻射降解、光降解、超聲波降解和微波降解法等。主要方法有以下幾種： 熱降解 Tang 等人 [17]將殼聚糖置于 280℃ 環(huán)境下進(jìn)行熱降解，研究發(fā)現(xiàn)降解后的殼聚糖在1590cm1 處對(duì)應(yīng)的氨基吸收減弱， 1650cm1 處對(duì)應(yīng)的乙?；赵鰪?qiáng)，這些變化可能是吡喃環(huán)受熱后被破壞所引起，還可能由于大量殼聚糖鏈發(fā)生熱交聯(lián)所引起；并且熱降解后，893cm 1153cm1對(duì)應(yīng)的糖的特征吸收減弱，并且峰行變寬，這些信息表明殼聚糖熱降解后 β(1,4)糖苷鍵斷裂。 γ射線輻射降解 在一定輻射劑量照射下， γ 射線能有效降解殼聚糖，得到低分子量的殼寡糖。隨著輻射量的增加，產(chǎn)物的顏色逐漸加深。 用 γ射線照射殼聚糖進(jìn)行輻射降解的反應(yīng)遵循無(wú)規(guī)降解動(dòng)力 學(xué)規(guī)律，降解過(guò)程中殼聚糖的脫乙酰度略有升高，降解反應(yīng)主要由殼聚糖分子鏈上的 C1OC4 鍵斷裂引起，在降解過(guò)程中生成了 δ內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的端基。 光降解 紫外線、可見(jiàn)光和紅外線對(duì)殼聚糖進(jìn)行照射也可以引起殼聚糖的降解反應(yīng)，此為光降解。 IR 分析表明，光降解過(guò)程中殼聚糖分子鏈上的乙酰氨基 葡萄糖單元發(fā)生了脫乙?；磻?yīng)，導(dǎo)致自由氨基數(shù)量增加，同時(shí) β(1, 4)糖苷鍵斷裂，降解過(guò)程中會(huì)生成羰基。紫外光降解反應(yīng)可能是自由基降解機(jī)理。 異相體系中低分子量殼聚糖的制備 10 在微波照射下，添加一些無(wú)機(jī)鹽，可有效地提高殼聚糖的降解速度，其降解物的分子質(zhì)量比用傳統(tǒng)加熱方法制備的要低。 超聲波降解 超聲波對(duì)殼聚糖的降解加速作用歸功于超聲波的“聲空化”作用。 對(duì)殼聚糖的降解反應(yīng)，主要是超聲波的機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)在起作用。用超聲波對(duì)殼聚糖進(jìn)行降解，反應(yīng)溫和，可在低溫下進(jìn)行，作用十分明顯。另有研究表明，延長(zhǎng)超聲波的作用時(shí)間，可以使降解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布明顯變窄，從而得到較為均一的低相對(duì)分子質(zhì)量殼聚糖；同時(shí)，降解過(guò)程中殼聚糖的氨基含量不隨降解時(shí)間而變化。 酶降解法 酶法降解殼聚糖，就是用特定的酶對(duì)殼聚糖進(jìn)行降解，特定的酶可以選擇性地切斷殼聚糖分子中的 β(1,4)糖苷鍵，從而制得特定分子量的低聚殼聚糖，克服了化學(xué)降解產(chǎn)物分子量分布寬、均一性差的缺點(diǎn)。目前，已發(fā)現(xiàn)有幾十種酶能用于殼聚糖的降解。 (1)專(zhuān)一性酶降解法 專(zhuān)一性酶主要是指甲殼素酶和殼聚糖酶。該酶系一般被誘導(dǎo)為多酶復(fù)合體：即甲殼素外切酶、內(nèi)切酶和 βN乙酰氨基葡萄糖苷酶。殼聚糖酶主要存在于真菌細(xì)胞中，根據(jù)作用模型可分為外切型和內(nèi)切型兩種，內(nèi)切型殼聚糖酶以釋放二聚體、三聚體或低聚糖為主，外切型則從殼聚糖的非還原末端產(chǎn)生單糖殘基即氨基葡萄糖。在目前沒(méi)有辦法獲得大量而廉價(jià)的殼聚糖專(zhuān)一性酶的情況下，采用非專(zhuān)一性的酶降解殼聚糖無(wú)疑具有很高的現(xiàn)實(shí)意義。 從各類(lèi)酶的作用效果及酶的來(lái)源分析，如此廣泛的酶似乎不存在共同的催化基團(tuán)，其具體的降解機(jī)理尚未能得到合理的解釋。 Tom225。降解產(chǎn)物用高效液相色譜分離 ,發(fā)現(xiàn)用胃蛋白酶水解殼聚糖得到接近產(chǎn)率為 52%的低聚殼聚糖 ,而用其他酶水解不超過(guò) 46%。若將非專(zhuān)一性水解酶按比例配合，利用酶之間水解作用的協(xié)同或互補(bǔ)效應(yīng)可進(jìn)一步提高對(duì)殼聚糖的水解程度。 糖基轉(zhuǎn)移法 糖基轉(zhuǎn)移法又稱(chēng)酶法合成，是建立在酶反應(yīng)基礎(chǔ)上，利用低聚合度寡糖在酶參與作用下，延長(zhǎng)糖鏈成為高聚合度甲殼低聚糖。而酶法合成則可在溫和條件下進(jìn)行，且不需要進(jìn)行羥基保護(hù)過(guò)程。另外，將酶和超濾膜相結(jié)合制成膜過(guò)濾酶反應(yīng)器，也可實(shí)現(xiàn)殼聚糖的連續(xù)生產(chǎn)。 Wang 等在殼聚糖溶液中加入雙氧水，然后用低壓水銀燈發(fā)出的 254nm紫外光照射溶液 30min，發(fā)現(xiàn)紫外光對(duì)雙氧水降解殼聚糖具有協(xié)同作用?？梢?jiàn)，隨著低聚 殼聚糖制備研究的深入，將會(huì)出現(xiàn)更多的、更實(shí)用的聯(lián)合降解工藝。從真菌提取具有易操作、易控制、易制備高質(zhì)量殼聚糖的優(yōu)點(diǎn)，而且在不同的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件下用不同的菌株可以制備不同分子量的低聚殼聚糖，在提取過(guò)程中減少了由于使用酸堿所帶來(lái)的環(huán)境污染，是直接制備低聚殼聚糖的一種新的綠色工藝。將低分子量水溶性殼聚糖 50mg 加 150 μL 8氨基萘 1,3,6三磺酸鹽 (ANTS，溶于HAcH2O 中 )衍生物，并于 200 μL 1M NaBH3CN 絡(luò)合 (40℃ 水浴反應(yīng) 15h)，使糖鏈帶負(fù)電荷，且具有發(fā)色團(tuán)和熒光特性。通過(guò)峰面積計(jì)算各種聚合度的寡糖占總水解產(chǎn)物的百分比?；瘜W(xué)方法操作繁瑣、耗時(shí)較多，而儀器方法一般較昂貴。該反 應(yīng)的等當(dāng)點(diǎn)約在 pH=左右。不同的測(cè)定方法得到的平均相對(duì)分子質(zhì)量的意義不同：凝膠滲透色譜法測(cè)得的是重均相對(duì)分子質(zhì)量和數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量，光散射法測(cè)的是重均相對(duì)分子質(zhì)量（ Mw） ，滲透壓法、蒸汽青島科技大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 13 壓滲透計(jì)法和端基法測(cè)得的是數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量 (Ma),黏度法只適合測(cè)定黏均相對(duì)分子質(zhì)量 (Mv)，而且測(cè)定的相對(duì)分子質(zhì)量的適用 范圍為 10000 以上。高效毛細(xì)管電泳具有高分辨率、高靈敏度及快速分離的特點(diǎn)，廣泛用于寡糖的結(jié)構(gòu)測(cè)定。端基法因其不需要特殊的儀器設(shè)備，并且操作方便，應(yīng)用較為廣泛，但誤差較大。 實(shí)驗(yàn)表明 :含有 1~6 糖單位的殼聚糖寡糖在實(shí)驗(yàn)所選定的展層系統(tǒng)中分離效果很好 :無(wú)拖尾，標(biāo)準(zhǔn)品中的 6 個(gè)糖都分離得很清楚，殼聚糖寡糖點(diǎn)呈棕黃色，分離點(diǎn)都呈圓形。與高效液相色譜法 (HPLC)結(jié)合是一種可靠的殼聚糖寡糖分析方法。幾個(gè)特征峰如 3450cm1 的 OH 伸縮吸收峰， 2567cm1的 CH 伸縮吸收峰， 1665cm1， 1550cm1的酰胺峰都存在。在殼聚糖降解前后 3400cm1左右的 NH 伸縮振動(dòng)、 1600cm1左右的 NH 彎曲振動(dòng)等主要峰的位置都無(wú)變化，只是隨殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量的降低各峰峰強(qiáng)有所變化，進(jìn)一步證實(shí)了該協(xié)同反應(yīng)是以開(kāi)裂殼聚糖的 β(1,4)糖苷鍵來(lái)進(jìn)行 [23]。 異相體系中低分子量殼聚糖的制備 14 2. 異相體系中制備低分子量殼聚糖 黏度法測(cè)原料殼聚糖分子量 實(shí)驗(yàn)原理 黏度反映了高聚物的相對(duì)分子質(zhì)量大小，通過(guò)一定的方法測(cè)定出殼聚糖的黏度，就可以推測(cè)計(jì)算出其相對(duì)分子質(zhì)量。工業(yè)上常采用旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)快速測(cè)定指定濃度的黏度 (單位 :Pa烏氏黏度計(jì)如圖 21所示： 圖 21:烏氏黏度計(jì) : Ubbelohde viseter 用烏氏黏度計(jì)測(cè)定高聚物相對(duì)分子質(zhì)量的原理如下： 黏性液體在流動(dòng)過(guò)程中所受阻力的大小可用黏度系數(shù) η（簡(jiǎn)稱(chēng)黏度）來(lái)表示，高聚物溶液的黏度是高聚物分子間的內(nèi)摩擦力、高聚物分子和溶劑分子間的內(nèi)摩擦力以及溶劑分子間內(nèi)摩擦力三者之和。 — 純?nèi)軇┑酿ざ? ηr 錯(cuò)誤 !未找到引用源。 、 比濃對(duì)數(shù)黏度為 ln ηr/c ，特性黏度為 [η]錯(cuò)誤 !未找到引用源。在足夠稀的高聚物溶液中， ηsp /c 和 c、 ln ηr/c 和 c 之間分別符合下述經(jīng)驗(yàn)關(guān)系式： ηsp /c=[η]+κ[η]2c ln ηr/c=[η]β[η]2c 青島科技大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 15 式中， κ和 β是兩個(gè)常數(shù)。 對(duì) c、 ln ηr/c 對(duì) c 作圖，外推至 c→0 時(shí)所得的截距即為 [η]。 王偉等 [24]以 mol/LCH3COONa+ mol/LCH3COOH 為溶劑，在 30℃ 下用光散射法定出不同脫乙酰度殼聚糖的 K 和 α值，結(jié)果顯示，殼聚糖的脫乙酰度越大， α越小，分子鏈的剛性越小，殼聚糖溶液的黏度越小。m3)和純?nèi)軇┑酿ざ?，溶液的密度和純?nèi)軇┑拿芏瓤山瓶醋飨嗤湎鄬?duì)黏度可以表示為： ηr =η/η0 = t/t0，式中， η、 η0分別為溶液和純?nèi)軇┑酿ざ龋?t 和 t0分別為溶液和純?nèi)軇┑牧鞒鰰r(shí)間。 另外，由于用黏度法測(cè)定高聚物分子量的 ηr為 ，據(jù)此，測(cè)定殼聚糖的黏均分子量，在 25℃下其最適宜的濃度范圍是 103g/ml，若當(dāng)初始濃度高于上限時(shí)， ηr值大于 ， 使 lgηr/c 對(duì) c 的實(shí)驗(yàn)曲線向上彎曲，影響外推值；當(dāng)濃度低于下限時(shí)，溶液與溶劑的流出時(shí)間非常接近，會(huì)產(chǎn)生較大的系統(tǒng)誤差。 材料與儀器 （ 1） 實(shí)驗(yàn)材料：殼聚糖（ 生化試劑， 濟(jì)南海得貝生物制藥 ）；冰醋酸（分析純，天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；氯化鈉（分析純，天津登科化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水 （ 2）實(shí)驗(yàn)儀器： 分析天平（型號(hào) EL204，梅特勒 托利多儀器有限公司）；烏氏粘度計(jì)（內(nèi)徑 ~，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司）；玻璃恒溫水??；循環(huán)水式多用真空泵；多頭磁力攪拌器；秒表；洗耳球；保鮮膜；玻璃砂芯漏斗 1 個(gè)； 250mL、 500mL容量瓶各 1 個(gè)； 500mL 抽濾瓶 1 個(gè)； 10mL 移液管 2 支； 2mL 移液管 1 支； 100mL、 200mL燒杯各 1 只 實(shí)驗(yàn)方法 （ 1） （殼聚糖溶劑）的配制： 精確稱(chēng)取 固體，加適量蒸餾水溶于 100mL 燒杯中，移液管量取 冰醋酸溶于燒杯中；將燒杯中溶液移入 500mL 容量瓶，用蒸餾水洗滌燒杯 3 次，洗滌液移入容量瓶；用蒸餾水定容至刻度線，搖勻，備用。 ②將溶解過(guò)后的殼聚糖溶液移入 250mL 容量瓶中，用 NaCl HAc 溶液洗滌燒杯 3 次，洗液移入容量瓶；用 NaCl HAc 溶液定容至刻度線、搖勻。 （ 3）烏氏黏度計(jì)測(cè)分子量 ①將玻璃恒溫水浴調(diào)節(jié)至 ℃ ，在黏度計(jì)的 B、 C 兩管上分別裝上乳膠管。 ② 用移液管吸取 11mL 殼聚糖溶液，濃度記為 c1，由 A 口加入到干燥的黏度計(jì)中，恒溫 15min。重復(fù)這一操作至少三次，其時(shí)間相差不大于 ，取三次平均值。 ⑤依次由 A 管用移液管加入蒸餾水 4mL、 8mL，將溶液稀釋?zhuān)藭r(shí)溶液濃度分別為c c4，恒溫后按步驟 ③ 測(cè)定。 ⑦用移液管移取 15mLNaCl HAc 溶劑，加入到洗好的黏度計(jì)中，恒溫 15min 后按步驟 ③ 測(cè)定溶劑流經(jīng) a、 b 刻線的時(shí)間，記作 t0。 注意事項(xiàng)： （ 1） 恒溫水浴的溫度對(duì)粘度測(cè)定影響很大，要求水浴溫度波動(dòng)在 177。 （ 2）實(shí)驗(yàn)中，殼聚糖溶液的稀釋是直接在黏度計(jì)中進(jìn)行的，因此每加入一次溶劑都要充分混合溶液，并抽洗黏度計(jì)的 E 球和 G 球，使黏度計(jì)各處濃度相等。 （ 4）溶液加入時(shí)要將移液管伸入 A 管內(nèi)深處，以免殼聚糖溶液粘在管壁上，導(dǎo)致稀釋時(shí)濃度不準(zhǔn)。100ml1 t/s ηr lnηr ηsp 異相體系中低分子量殼聚糖的制備 18 ηsp/c ln錯(cuò)誤 !未找到引用源。 對(duì) c、 ln ηr/c 對(duì) c 作圖如下： 圖 22 ηsp /c c、 ln ηr/c– c ηsp /c c、 ln ηr/c – c 由圖中數(shù)據(jù)得： [η] =（ +） 247。 K= 103 ml/g 、 α = 1099478 端基法測(cè)低聚殼聚糖分子量 實(shí)驗(yàn)原理 端基分析法具有方法簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單、重復(fù)性較好且準(zhǔn)確性較高等特點(diǎn)，其所測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量。其中 ElsonMan 法操作繁瑣且回收率低，不適用于氨基糖與乙酰氨基糖混合的