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2024-10-15 14:54本頁面
【正文】 分子的遷移速度則主要取決于 蛋白質(zhì) 分子大小 當?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在 15,000－ 200,000之間時 ， 樣品的遷移率與其分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系 。 當條件一定時 ， b與 K均為常數(shù) 因此通過 已知分子量的蛋白與未知蛋白的比較 ，就可以得出未知蛋白的分子量 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDSPAGE)按照緩沖液的 pH值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液 pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng) 不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分， pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳 Gel 5% 10% 15% 29 45 66 97 200 29 45 66 97 200 29 45 66 97 200 將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素 /PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進行反應(yīng)，洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入標記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標記抗體，加入適合標記物的檢測試劑進行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進行特異性蛋白的半定量 實驗操作大致流程圖 SDSPAGE電泳 轉(zhuǎn)膜（ PVDF或硝酸纖維素膜） 封閉 一抗 洗滌 酶標二抗反應(yīng) 洗滌 顯色或化學(xué)發(fā)光顯影 操作過程 , 準備 2個干凈的小燒杯 (放好密封條和隔離板 ) *固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板 分離膠 (10% 10ml) 濃縮膠 (5% 10ml) ddH2O 30%Acr Buffer TrisHCl TrisHCl 10%SDS 100181。l 10%Ap 50181。l TEMED 10181。l 配 膠 ,用移液管快速加入（或直接用小燒杯倒入） ,大約 5厘米左右 ,之后加少許蒸餾水（或異丙醇 除泡 ） ,靜置至膠凝 * 凝膠配制過程要迅速 , 催化劑 TEMED要在注膠前再加入 ,否則凝結(jié)無法注膠。l （ 2）細胞樣品 10 181。l 共20181。l *微量注射器不可過低 ,以防刺破膠體；也不可過高 , 樣品下沉?xí)r易發(fā)生擴散，溢出加樣孔 ，接通電源，進行電泳，開始電流恒定在 10mA（ 120V），當進入分離膠后改為
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