pcr技術(shù)及其應(yīng)用-展示頁
2024-08-19 22:46本頁面
【正文】 核苷酸 dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度 濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入 ,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與 Mg2+結(jié)合 ,使游離的 Mg2+濃度下降 ,影響 DNA聚合酶的活性。濃度為 。 Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合 ,所以反應(yīng)體系中 dNTP、 EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的 Mg2+濃度。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合 。 引物設(shè)計(jì)： （ 1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū) ,與非擴(kuò)增區(qū)無同源 序列。 （ 3） 堿基盡可能隨機(jī)分布 ,G+C占 4060%。 （ 5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。 Tm =（ G+C） x 4 + （ A+T） x 2 （ 3）延伸 7075℃, 一般為 72℃ 延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長度決定 （ 4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版 DNA的濃度 一般為 2535次 次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低 錯(cuò)誤摻入率增加 PCR的應(yīng)用 特定 DNA片段（基因、調(diào)控序列）的鑒定、分離或制備。 內(nèi)摻式染料 SYBR Green I 序列特異性探針 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特異性探針 Amplifluor (Intergen) 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission SYBRGreen I 反向 PCR (reverse PCR) 擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列 用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的 DNA片段，對某個(gè)已知 DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。l體系）： 10 X PCR反應(yīng)緩沖液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物 1 10μmol/L引物 2 模板 DNA TaqE 補(bǔ)充水
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