【正文】 開發(fā)的初期，由于各試劑廠家的質(zhì)量和反應特性有很大不同，試管的直徑壁厚都有所不同，導致檢測到的初始透光強度，和透光強度變化很不一致，將所有的反應曲線歸一化后，即反應初始認為濁度為零，反應結束時認為濁度為1，經(jīng)過歸一化的曲線很容易計算拐點，但該方法需要將完整的反應曲線檢測出來，才能準確判斷處理，否則容易誤判，造成假陽性，需要的檢測時間比較長，鱟試劑的靈敏度也要求比較高。T3T2T1T4透光率預設透光率時間 圖12 透光率下降法反應時間確定T50歸一化法細菌內(nèi)毒素與鱟試劑的動力學反應其吸光度的變化曲線符合動力學方程。第二節(jié) 反應時間的確定反應時間是動態(tài)濁度法進行定量測定的重要參數(shù)，反應時間標志著鱟試劑反應的快慢和樣品中細菌內(nèi)毒素的含量多少，目前在國際上開發(fā)的反應時間判定方法有以下三種：OD限值法、透光率限值法、T50歸一化法，OD限值法 測定反應曲線為吸光度變化曲線，預設一個吸光度OD值，當反應曲線從開始上升到該預設值時經(jīng)歷的時間作為反應時間，該方法的優(yōu)點是時刻變化的OD值是與反應產(chǎn)物的數(shù)量成正比的，也就是吸光度變化曲線與凝膠產(chǎn)物的產(chǎn)生關系為線性，我們也采用與國際上其他儀器相同的取值，該點在反應曲線上的位置為濁度開始快速變化的時期，該取值能夠快速、穩(wěn)定的獲得反應時間。二、終點分析方法終點濁度法：利用當反應曲線達到設定時間時的吸光度值與內(nèi)毒素含量的對數(shù)擬合標準曲線，由于凝膠以后濁度不再上升，所以所有參加計算的點必須在產(chǎn)生凝膠以前，否則將產(chǎn)生很大誤差。(該方法為我儀器默認方法，)曲線拐點T50法：檢測到反應曲線的拐點，即反應速率最大點的時間作為臨界時間，根據(jù)臨界時間的對數(shù)與內(nèi)毒素含量的對數(shù)成反比的規(guī)律來定量。 技術支持：易泰實驗室地址：天津大學無線電廠 開發(fā)部郵編：300072電話：02283713051傳真：02283713052網(wǎng)址：第一章 細菌內(nèi)毒素測定儀應用的鱟試驗原理鱟試劑發(fā)明以來，人們根據(jù)它與細菌內(nèi)毒素的反應特性開發(fā)了多種實驗方法，只有凝膠法成為一種公認的法定方法被全世界承認，基于凝膠特性的動態(tài)濁度法也被各國藥典收載，鱟試劑凝膠過程同時伴隨著濁度變化，利用濁度變化的動力學特性建立動態(tài)濁度法。 為更好地發(fā)揮本儀器的性能，請詳細閱讀使用說明書，和有關其它文獻，如果您在實驗中遇到問題，請及時與我們聯(lián)系，以便為您提供及時的技術支持?！笔俏覀円滋嶒炇业淖谥迹弧癆lways try it for best”是我們的信念, 希望我們的工作給您予幫助。相信憑著我們良好的信譽，優(yōu)良的品質(zhì)，快捷的服務，一定會使您在工作中得心應手。由于不能一一盡列，在這里我要對所有對我們的儀器提出建議及批評，所有幫助過我們的老師和朋友們一并表示感謝。中國藥典(2000年版)也正式收載了“細菌內(nèi)毒素檢查法”，并對鱟試劑、內(nèi)毒素標準、試驗程序、判斷標準作了規(guī)定，在這種條件下，應用細菌內(nèi)毒素測定儀來進行內(nèi)毒素的定量檢測，對提高檢測水平和制藥單位提高全面質(zhì)量控制，具有十分重要的意義。自從美國藥典20版(1980年)收載了“細菌內(nèi)毒素檢查法”以來，美國藥典收載的藥品中，原規(guī)定的熱原檢查項逐漸被細菌內(nèi)毒素檢查項所取代，一些原來未規(guī)定熱原檢查項的品種也增設了細菌內(nèi)毒素檢查項。 1964年 Jack Levin和 Frederik B．Bang等人發(fā)現(xiàn)細菌內(nèi)毒素可以迅速引起鱟血細胞溶解物(鱟試劑)發(fā)生凝集反應，從而導致產(chǎn)生了目前最靈敏的細菌內(nèi)毒素檢查方法。細菌內(nèi)毒素測定儀系列使用說明天津大學無線電廠細菌內(nèi)毒素測定儀使用說明書目 錄第一章 細菌內(nèi)毒素測定儀應用的鱟試驗原理 2第一節(jié) 定量分析方法 2一、動態(tài)分析方法 2二、終點分析方法 2第二節(jié) 反應時間的確定 2OD限值法 3透光率限值法 3T50歸一化法 4第三節(jié) 測定原理 4反應時間法標準曲線的測定未知內(nèi)毒素原理 4反應速率法標準曲線的測定未知內(nèi)毒素原理 5第二章 試驗前期工作 7試驗器材準備 7試驗所需試劑 7試驗用具的處理： 7實驗器具在實驗中的作用 8第三章 動態(tài)濁度法試驗中常見問題 9供試品細菌內(nèi)毒素限值的計算 9供試品最大有效稀釋倍數(shù)的計算 9標準曲線的構造 10陰性對照 10供試品溶液中干擾物質(zhì)的處理方法 10供試品回收試驗及內(nèi)毒素檢測 11基本概念 11回收實驗管的制備 12不干擾稀釋倍數(shù)的選擇 12樣品中葡聚糖的鑒別 12檢測結果數(shù)據(jù)處理分析 13內(nèi)毒素標準曲線的寬窄問題： 14鱟試驗過程中注意事項： 14第四章 細菌內(nèi)毒素測定儀的使用 16一．儀器概述 16儀器適用范圍 16適應三類鱟試劑： 16三種定量分析方法： 16性能參數(shù) 17軟件運行環(huán)境： 18軟件特點: 18二．軟件安裝指南 18三．軟件與儀器通訊 19四．軟件使用詳述 20（一）主界面 201．文件管理欄 211．1 檢品管理中心 211．2 當前打開檢品文件 212． 菜單欄 222．1 退出 222．2 參數(shù)設定 222．3 數(shù)據(jù)合并 222．4 網(wǎng)站鏈接 232．5 新實驗 232．5．1 標準曲線設置 232．5．2 樣品設置 242．5．3 陰性陽性對照設置 262．5．4 試管位置設置 262．5．5 向?qū)褂谜f明 26（二）子界面 26實驗數(shù)據(jù)表格 28觀察反應曲線 281． 實驗數(shù)據(jù)記錄 29實驗數(shù)據(jù)表格 30實驗分析方法： 312. 觀察反應曲線 323． 結果打印預覽 35五．軟件使用常見問題 37 37如何進行實驗數(shù)據(jù)的添加與刪除 37如何進行溫度設定與校準 37如何識別試管插入后檢測與否 37檢測報告中實測內(nèi)毒素數(shù)值打“？”為何意 38檢測報告中“〈檢測限！”的標識為何意 38實驗中空白表格填寫注意事項 38第五章 實驗操作指南 39實驗設置向?qū)?39內(nèi)毒素標準曲線制作試驗 40稀釋法示例1：湛江海洋鱟試劑 41稀釋法示例2：湛江海洋鱟試劑 43稀釋法示例3：廈門鱟試劑廠鱟試劑 46稀釋法示例4：福州新北鱟試劑 48稀釋法示例5：顯色鱟試劑 51附1 細菌內(nèi)毒素實驗動態(tài)濁度法標準曲線的準確度 54標準曲線的誤差 55標準曲線的高次曲線擬合 57附2 2000年藥典細菌內(nèi)毒素定量測定法 58附3 細菌內(nèi)毒素實驗配套器材及消耗材料 60附4　實驗操作流程和注意事項 60附5　易泰實驗室介紹 61前 言60尊敬的用戶，感謝您選用本儀器，同時祝賀您獲得了細菌內(nèi)毒素定量檢測的有力武器。您可以將它應用于注射藥品、輸液器具、生產(chǎn)工藝控制、臨床檢測體液等方面。這種方法經(jīng)不斷完善，應用越來越廣泛。美國藥典24版(2000年)收載的藥品中，有586種規(guī)定了細菌內(nèi)毒素檢查項。 經(jīng)過多年的努力，在1993年，由開封155醫(yī)院、中國藥品生物制品檢定所、天津大學無線電廠聯(lián)合研制成功BET32型細菌內(nèi)毒素測定儀，開始了我國應用國產(chǎn)儀器進行細菌內(nèi)毒素定量檢測的先例，在儀器推出的幾年內(nèi)，得到了用戶的大力支持，紛紛將儀器應用于生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制，并取得了較好的效果，提高了檢測水平，同時也對我們深入開發(fā)新一代儀器，提供了很大的幫助。為了更快的推進我國細菌內(nèi)毒素的發(fā)展，更方便用戶使用，2001年我們推出性能指標可與國外同類產(chǎn)品相媲美BET72型細菌內(nèi)毒素測定儀?！疤峁┳詈啽愕脑囼灧椒?，最可靠的實驗儀器，最齊全的試驗材料，最新的相關信息。我們真誠希望廣大的用戶在使用過程中發(fā)揮聰明才智，更好地利用儀器和試劑，提高檢測水平和擴大檢測品種，總結檢測技術；也希望您與我們聯(lián)系，給我們多提供寶貴資料，多多支持，共同推動我國的內(nèi)毒素事業(yè)的發(fā)展，使我國鱟試劑的應用水平達到國際先進行列。 愿您在使用BET系列細菌內(nèi)毒素測定儀的過程中得心應手。第一節(jié) 定量分析方法根據(jù)鱟試劑與細菌內(nèi)毒素反應快慢與內(nèi)毒素含量相關的特點，無論是濁度法鱟試劑還是動態(tài)比色法鱟試劑都能檢測鱟試驗反應的透光實時變化曲線，可以建立曲線分析方法，其中根據(jù)動力學反應曲線的特征建立以下分析方法：一、動態(tài)分析方法預設限值法：當反應曲線的OD值上升到預設的限值的時間，或透光率下降到預設限值的時間作為臨界時間，根據(jù)臨界時間的對數(shù)與內(nèi)毒素含量的對數(shù)成反比的規(guī)律來定量。反應速率法：檢測到反應曲線的最大反應速率，即曲線的最大斜率，該斜率的大小與內(nèi)毒素含量的對數(shù)成正比。終點比色法：利用終點比色試劑根據(jù)內(nèi)毒素多少釋放對硝基苯胺PNA，檢測黃色的PNA含量或用偶氮化試劑將其變成顏色更深的粉紅色，用光度計讀吸光度，根據(jù)該吸光度與內(nèi)毒素含量的對數(shù)成正比的規(guī)律來定量。T3T2T1OD預設OD值時間T4 圖11 吸光度限值法反應時間確定透光率限值法使用透光率描述鱟試劑的濁度變化，吸光度實際就是透光率的負對數(shù)值，日本的ET201型儀器采用透光率下降到95%的點作為反應時間臨界點，將95%，所以該法與OD限值法選取的凝膠臨界點是相同的，但該法所描繪的透光率反應曲線與反應產(chǎn)物的量是非線性關系。曲線的‘拐點’即反應速度最快點，將拐點的時刻作為反應時間，是該反應曲線最富于特征的點，為尋找拐點特發(fā)明了歸一化方法、在檢測過程中由于試劑中雜質(zhì)、氣泡、以及電磁干擾等問題的存在，檢測到的反應曲線有時發(fā)生扭曲，如果直接計算拐點和斜率經(jīng)常發(fā)生較大誤差，由于拐點是該曲線的中心對稱點,與濁度達到50%的點極為接近,用該點代替拐點有很高的穩(wěn)定度。第三節(jié) 測定原理反應時間法標準曲線的測定未知內(nèi)毒素原理理論分析和大量試驗表明，無論以哪種方法確定的反應時間，它都是內(nèi)毒素含量的標志，內(nèi)毒素濃度和成膠時間為負相關，即內(nèi)毒素濃度越高成膠時間就越短。在對實驗品進行檢測時，根據(jù)試驗品的臨界反應時間和式()，即可求出其內(nèi)毒素濃度值【1】。在對試驗品進行檢測時，根據(jù)試驗品的最大的反應速率Vmax代入標準曲線方程，即可求出其內(nèi)毒素濃度值。2． 鱟試劑　　本儀器適用國內(nèi)各鱟試劑廠家生產(chǎn)的定量鱟試劑，另外，滿足以下要求的鱟試劑將能夠獲得非常理想的檢測效果：溶解后澄清度高、最大濁度變化大，靈敏度高（，但速度過快也不好，操作的速度將影響結果，）。反應時間最好要大于7200秒。方法1：用硫酸洗液浸泡612小時后，用清水洗凈，再用蒸餾水沖洗，最后放入烤箱，在250℃的溫度下烘烤2小時，即可除掉熱原。（推薦）另外還有用雙氧水浸泡等方法，但耗時較長。我實驗室用方法2處理玻璃用具，實驗表明此方法比常用的方法1省時、安全，效果理想，特此推薦。 第三章 動態(tài)濁度法試驗中常見問題供試品細菌內(nèi)毒素限值的計算 供試品內(nèi)毒素限值按以下公式確定： L＝K/M 式中 L為供試品內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。h表示，注射劑K＝5EU/(kgh)鞘內(nèi)注射劑K= EU/(kgh)、mg/(kgh)表示，中國人均體重按60kg計算, 注射時間小于1小時，按1小時計算。供試品最大有效稀釋倍數(shù)的計算含標準內(nèi)毒素的供試品溶液的制備 　首先按下式計算供試品溶液的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）和干擾試驗中供試品的稀釋倍數(shù)(D)。C為供試品溶液的濃度,其中當L以EU/ml表示時，當L以EU/mg或EU/u表示時，C的單位為mg/ml或u/ml。 2）干擾實驗中供試品的稀釋倍數(shù)D 公式D=LC/λm中為所做標準曲線中間點的濃度，此公式的意義在于，供試品D倍稀釋后所測內(nèi)毒素值會落在標準曲線的中間，減少其所測值的誤差。例如：某供試品L=1EU/ml，標準曲線所做點為1，通常對倍稀釋4個點時λm取值為4λ1=，MVD=L/λ1=8，在做4，8倍的干擾實驗時發(fā)現(xiàn)稀釋8倍后樣品所測值較為理想，此時D=8，則λm= L/D=，使8倍稀釋后的樣品所測值落在標準曲線中間。一般情況下，只需檢測值不超出標準曲線范圍即可，因為該操作的誤差影響在整個實驗中的所占比重不大。　　10倍稀釋所得的標準曲線的檢測范圍寬，所以，當我們不知道所要檢測的樣品內(nèi)毒素含量的確切范圍或者是要同時檢測幾種限值相差很大的樣品的時候，那么使用10倍稀釋有標準曲線就比較方便，可以做到一步到位?！　⒓毦鷥?nèi)毒素標準品用細菌內(nèi)毒素檢查用水按等比例稀釋（如對倍稀釋，10倍稀釋等，制備成一個至少包含四個標準濃度的標準系列溶液，, , , ，1，），且每個數(shù)量中至少要有一個標準濃度?！　≡诙繙y定中，＂λ＂不是指鱟試劑的標示靈敏度，而是表示標準曲線中最低的標準濃度，即該曲線的最低檢測限值。 陰性對照 陰性對照的目的一是為了測定用于稀釋標準品系列和樣品水中的內(nèi)毒素含量，確保其不會影響試驗的可靠性；二是為了檢測鱟試劑的質(zhì)量。供試品溶液中干擾物質(zhì)的處理方法作為供試品溶液中的干擾物質(zhì)一般采用稀釋法即可排除，對于用稀釋法不能解決的樣品，可采用其它方法給予排除，如加熱法、PH調(diào)節(jié)法、溶液過濾等方法。常用的處理方法有以下幾種。如高濃度的葡萄糖注射液等。如某些血液制品和生物制品等。這就可用預先處理并已確認無菌無熱原的鹽酸或氫氧化鈉液調(diào)整樣品液PH。4．超濾——反沖法一般中草藥注射液成分復雜，干擾因素較多，難以用普通