【正文】 濃度達(dá) 100萬一 200萬個細(xì)胞／ m1，分裝于安瓿中，封口， 4℃ 預(yù)冷 30min，封口嚴(yán)密的安瓿移至 50～－ 70?C冰箱中預(yù)冷，然后移至液氮罐內(nèi)貯存，可保存數(shù)年。適宜于許多動物病毒的生長，易于培養(yǎng)，可以建立種子庫，質(zhì)量易控制。 ? 3）傳代細(xì)胞系 由腫瘤組織培養(yǎng)而成或由細(xì)胞株轉(zhuǎn)化而來。二倍體細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)可能發(fā)生變化，但細(xì)胞染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣。但原代細(xì)胞不能在體外多次傳代，組織原材料的來源不固定，易混入外源病原，造成外源病毒污染，不易控制其質(zhì)量，影響產(chǎn)品的純凈和安全性。 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)類型 （ 1）原代細(xì)胞 原代細(xì)胞是用動物新鮮組織如胚胎或幼畜的組織或受精卵，經(jīng)胰蛋白酶消化分散后制備而成。血清起營養(yǎng)作用，保護(hù)細(xì)胞或去毒，抑制蛋白溶解酶，促進(jìn)細(xì)胞在玻璃上附著和鋪開。在不含血清的培養(yǎng)液中，常含有脂溶性維生素。 病毒細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求 ? 4) 維生素 大部分維生素與細(xì)胞代謝有關(guān)。 ? 3) 氨基酸 細(xì)胞培養(yǎng)所用的氨基酸為左旋異構(gòu)體。 ? 2) 碳水化合物 常用的碳水化合物是葡萄糖。 、病毒培養(yǎng)基本技術(shù) ? 病毒細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求 ? 1）無機離子 維持滲透壓、提供細(xì)胞酶與代謝活動所需要的物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞貼壁等。 、病毒培養(yǎng)基本技術(shù) ? 病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物，由于病毒缺乏自主復(fù)制的酶系統(tǒng)，不能獨自進(jìn)行物質(zhì)代謝，必須依賴宿主細(xì)胞或細(xì)胞的某些成分合成核酸和蛋白質(zhì)，所以只能在易感的細(xì)胞內(nèi)以復(fù)制的方式進(jìn)行增殖，而不能在任何無細(xì)胞的培養(yǎng)液內(nèi)生長。 ? 在沒有條件的實驗室，簡便的做法是用有蓋玻璃容器，放入接種的培養(yǎng)物后，點燃蠟燭，加蓋密閉容器，由于燃燒耗氧產(chǎn)生二氧化碳，蠟燭即熄滅。常用的有厭氧罐法。 厭氧菌的培養(yǎng) ? 化學(xué)方法 利用還原作用強的化學(xué)物質(zhì)，吸收環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的養(yǎng)氣或還原氧化型物質(zhì)，降低氧化還原電勢。 、細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù) ? 厭氧菌的培養(yǎng) ? 生物學(xué)方法 在培養(yǎng)基中加入植物或動物組織（如馬鈴薯、發(fā)芽谷物、滅菌的新鮮動物組織塊），以消耗養(yǎng)氣或使氧化還原電勢下降。 ? 抑菌分離培養(yǎng) 利用某些化學(xué)藥品對某類細(xì)菌的抑制或殺滅作用，而對另一些細(xì)菌不生產(chǎn)明顯的作用，來分離培養(yǎng)某些細(xì)菌。 、細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù) 需氧菌的培養(yǎng) ? 平板培養(yǎng)法 有平板劃線培養(yǎng)法和傾注培養(yǎng)法。烈性傳染病或人畜共患傳染病的強毒菌（毒）種，必須有專職技術(shù)人員領(lǐng)取。有產(chǎn)品批準(zhǔn)文號者，可由生產(chǎn)企業(yè)直接向菌種中心或分中心領(lǐng)取。 ? 索取：須持有相應(yīng)級別機構(gòu)出具的正式公函，說明菌種名稱、型別、數(shù)量及用途。 ? 原種和由國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心或分中心負(fù)責(zé)保管；基礎(chǔ)種子由菌種中心或分中心負(fù)責(zé)制備、鑒定、保管和供應(yīng)；生產(chǎn)種子由生產(chǎn)企業(yè)自行制備、鑒定和保管。 ? 動物繼代保存 蟲種一般通過動物繼代保存。 ? 結(jié)凍保存 有些病毒可用含毒組織在低溫條件下（ 20?C以下）。 ? 毒種的選育 弱毒毒種有天然弱毒株或人工致弱毒株；強毒毒株分離 → 系統(tǒng)鑒定（無污染、毒力強而穩(wěn)定、免疫原性好、抗原譜廣、與流行毒血清型相符） → 疫苗候選株。病毒生產(chǎn)種子應(yīng)作含量測定和純凈檢查。 ? 生產(chǎn)種子 生產(chǎn)種子由生產(chǎn)企業(yè)用基礎(chǔ)種子進(jìn)行復(fù)壯、繁殖。病毒原種應(yīng)規(guī)定其生物學(xué)特性、理化特性、血清學(xué)特性、最小感染量、最小免疫量、安全性等，并純粹。 菌（毒）種 ? 、 菌（毒）種 標(biāo)準(zhǔn) ? 歷史清楚； ? 生物學(xué)性狀明顯； ? 遺傳穩(wěn)定； ? 優(yōu)良的免疫原性與反應(yīng)原性； ? 毒力在規(guī)定的范圍內(nèi)。 ? 轉(zhuǎn)移因子：用動物臟器或組織提取制成，作為非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，增強機體免疫力，提高生產(chǎn)性能。 ? 卵黃抗體：用抗原多次免疫禽類，提取卵黃抗體制成，用于治療或預(yù)防動物疾病。 （三）治療及其他制品 ? 抗血清：用抗原多次免疫動物，提取血清制成，用于治療或預(yù)防動物疾病。 ? 基于核酸序列擴增技術(shù)（ NASBA）。 ? PCR（ RT－ PCR）擴增技術(shù)。 生物技術(shù)和分子生物學(xué)診斷技術(shù) ? （ 1）生物技術(shù)：單克隆抗體技術(shù)（熒光抗體染色技術(shù)或酶聯(lián)免疫染色技術(shù)）。 ? （ 7）膠體金免疫檢測技術(shù)。 常規(guī)免疫 — 血清學(xué)診斷技術(shù) ? （ 5）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ ELISA）：包括直接法、間接法、雙抗體夾心、競爭 ELISA等。 ? （ 3）中和試驗：將特異性血清與相應(yīng)病原混合，用血清 — 病毒混合物接種靶動物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)，觀察感染情況進(jìn)行疾病診斷。 間接凝集試驗（ 間接血凝、膠乳凝集和反相間接血凝試驗 ）。制造簡便、成本低、安全、免疫期長、熱穩(wěn)定性好，但仍未商品化生產(chǎn)?？梢酝瑫r表達(dá)多種抗原，制成多價或多聯(lián)疫苗，毒力不返強。疫苗毒力不易恢復(fù)，穩(wěn)定性好，可配合鑒別診斷方法，區(qū)別免疫動物和自然感染動物。純度高、穩(wěn)定，但只能線性表達(dá)，不能折疊，免疫原性較差。 2）病原 → 基因工程技術(shù) → 保護(hù)性抗原基因序列插入合適的表達(dá)質(zhì)粒 → 高效穩(wěn)定表達(dá) → 生產(chǎn)抗原 → 亞單位疫苗。但可能存在不安全風(fēng)險。 4）基因工程改造弱毒株。 2）自然弱（無）毒（菌、蟲）株。 但用量較大、接種次數(shù)多、免疫力產(chǎn)生慢、注射困難、注射局部可能有反應(yīng)等。 2)滅活的毒素或提取的亞單位或 rDNA產(chǎn)生亞單位。 預(yù)防用獸用生物制品包括：滅活疫苗、活疫苗、重組亞單位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、重組活載體疫苗和核酸（ DNA）疫苗。 按照作用與用途 預(yù)防、診斷和治療用生物制品。獸用疫苗生產(chǎn) 一、獸用生物制品分類 二、獸用疫苗的制備技術(shù) 三、獸用診斷試劑的制備技術(shù) 四、獸用生物制品檢測技術(shù) 一、獸用生物制品分類 獸用生物制品系指用天然或人工改造的微生物（細(xì)菌、病毒、衣原體、鉤端螺旋體等）及其代謝產(chǎn)物、寄生蟲、動物血液或組織等為原材料，采用生物學(xué)、分子生物學(xué)或生物化學(xué)等相應(yīng)技術(shù)制成的生物制劑，用于預(yù)防、治療或診斷畜禽疫病。 按照性質(zhì)和制造方法 疫（菌）苗、類毒素、抗血清、診斷制劑和微生態(tài)制劑等。 （一）預(yù)防用獸用生物制品 將細(xì)菌、病毒、寄生蟲等接種于特殊基質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，收獲其抗原單位或亞單位，或用人工合成的抗原單位或亞單位制備而成的活的或滅活的、具有特異性和免疫原性的生物制品，用于預(yù)防靶動物的疾病。 滅活疫苗 (死疫苗 ) 1)強毒 (菌 )或弱毒（菌） → 培養(yǎng) → 滅活或加熱 → 純化或濃縮 → 佐劑或防腐劑。 滅活疫苗穩(wěn)定、安全，便于運輸和保存，易于提純純化和制備多價、多聯(lián)苗。 活疫苗 (弱毒疫苗 ) 1）致弱的弱毒（菌、蟲）株 動物、組織、細(xì)胞、雞胚或培養(yǎng)基 → 培養(yǎng) → 降低毒力、保留免疫原性 → 篩選。 3）異種毒（菌、蟲）株。 活疫苗對原宿主動物無致病性或引起亞臨床感染，能產(chǎn)生主動免疫力，用量少、成本低、免疫力產(chǎn)生快、免疫期長。 重組亞單位疫苗 1）微生物 → 物理和化學(xué)方法→ 提取有效抗原成分。 合成肽疫苗 ? 用化學(xué)方法人工合成多肽作為抗原。 基因缺失疫苗 病原體 → 基因工程方法 → 缺失致病性基因或非必要糖蛋白 → 保持免疫原性 → 降低致病性。 重組活載體疫苗 ? 病原保護(hù)性抗原基因序列 → 插入另一種無毒或弱毒的微生物基因組 → 表達(dá)→ 構(gòu)建重組活載體疫苗株。 核酸疫苗（基因或 DNA疫苗） 病原保護(hù)性抗原基因 → 連接細(xì)菌或病毒 DNA → 直接導(dǎo)入動物體 →表達(dá)抗原 → 誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)。 （二）診斷用制品 ? 常規(guī)免疫 — 血清學(xué)診斷技術(shù) （ 1）凝集試驗抗原： 直接凝集試驗（平板法、試管法）：抗原和抗體混合后直接發(fā)生凝集反應(yīng)。 常規(guī)免疫 — 血清學(xué)診斷技術(shù) ? （ 2） 免疫沉淀試驗抗原：包括試管沉淀法、單相免疫擴散試驗和雙相免疫擴散試驗、免疫電泳、對流免疫電泳等。 ? （ 4）補體結(jié)合試驗抗原：抗原抗體復(fù)合物可以激活補體，出現(xiàn)各種生物學(xué)反應(yīng)。 ? （ 6）熒光抗體染色技術(shù)：直接法、間接法、競爭法等。 ? （ 8）免疫組化診斷試劑。 ? （ 2）分子生物學(xué)技術(shù)。 ? 熒光定量 PCR（ RT－ PCR）。 ? 核酸探針。 ? 微生態(tài)制劑：含活菌的制劑，具有調(diào)節(jié)機體菌群、增強免疫力、促生長等。 ? 干擾素：用病毒等誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素。 二、獸用疫苗制備技術(shù) ? （一）獸用滅活疫苗的制備技術(shù) 滅活疫苗是用菌（毒）種培養(yǎng)物或含毒組織或細(xì)胞培養(yǎng)物，經(jīng)化學(xué)滅活劑滅活或加熱處理，使微生物失去活性而保持免疫原性，再加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎┗蚣尤朊庖咦魟┲瞥伞? 、 菌（毒）種 標(biāo)準(zhǔn) ? 原種 細(xì)菌原種應(yīng)規(guī)定其培養(yǎng)特性、生化特性、血清學(xué)特性、毒力和免疫原性等，并作純粹檢查。 ? 基礎(chǔ)種子 基礎(chǔ)種子由原種制備而來，基礎(chǔ)種子為企業(yè)生產(chǎn)獸用生物制品提供種子來源，應(yīng)作系統(tǒng)鑒定，并規(guī)定代次。細(xì)菌等生產(chǎn)種子應(yīng)作純粹檢查。 、菌（毒）種選育 ? 菌種的選育 分離病原 → 純粹檢驗 → 致病性鑒定和抗原性測定 → 設(shè)計制成滅活疫苗 → 接種實驗室動物→ 攻毒 → 用本動物進(jìn)行保護(hù)率測定 → 以確定疫苗候選株。 、菌（毒）種保存 ? 冷凍真空干燥法 凍干的菌種一般在 2— 8?C保存；凍干的毒種一般在 20?C以下保存， 溫度越低保存期越長。 ? 液氮保存 有些細(xì)胞結(jié)合毒須在－ 196?C的液氮中保存。 、菌（毒）種的管理 ? 生產(chǎn)檢驗用菌（毒）種實行分級管理制度，種子分三級（原種、基礎(chǔ)種子和生產(chǎn)種子）。 、 菌（毒）種索取與分發(fā) ? 供應(yīng)：菌種中心及分中心統(tǒng)一供應(yīng)。一、二類菌種時，必須由?。ㄊ?、自治區(qū)）獸醫(yī)行政主管部門審核，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)后，方可供應(yīng)。 ? 要求：其他任何單位不得轉(zhuǎn)發(fā)生產(chǎn)用菌（毒）種。 、病原培養(yǎng) ? 細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù) ? 細(xì)菌的繁殖是以二分裂法進(jìn)行，分四個時期：遲緩期（細(xì)菌處于靜止適應(yīng)狀態(tài)）；對數(shù)增殖期（以恒定的速度增殖）；穩(wěn)定期（細(xì)菌增加數(shù)與死亡數(shù)保存平衡）；衰退期（活菌數(shù)下降）。 ? 需氧芽孢菌的培養(yǎng) 將接種材料先接種于液體培養(yǎng)基中，置水浴加入至 80?C，維持 15－ 20分鐘，以殺死非芽孢菌，然后在 37?C作增菌培