【正文】 ? 引物結(jié)合位點(diǎn)； (引物可以是一小段 DNA或是 RNA) ? 引物 339。 中主要的三種 DNA多聚酶 DNApolⅠ DNApol Ⅱ DNA pol Ⅲ 結(jié)構(gòu) 分子量 103 KD 90 KD 900 KD 構(gòu)成 單體 單體 異多聚體 分子數(shù) /細(xì)胞 400 ？ 1020 酶活性： 5 → 3`聚合酶 + + + 3`→ 5`外切酶 + + + 5`→ 3`外切酶 + － － (可切單鏈 ) 突變體 突變位點(diǎn) pol A pol B polC(dnaE), dnaN, dnaZX, dnaQ, dnaT 突變表型 修復(fù)有缺陷 能修復(fù) 阻止復(fù)制 （一） DNA聚合酶 I ? 發(fā)現(xiàn)：西班牙裔美國(guó)人 A. Kornberg等在 1956年完成第一例體外合成 DNA實(shí)驗(yàn)?！?339?！?339。缺失復(fù)制起始有關(guān)的酶。缺失復(fù)制體組分的 酶，特別是延伸的酶或參與供應(yīng)關(guān)鍵前體的酶。每一階段的蛋白質(zhì)和酶不完全相同，可利用如下 2種突變體來(lái)篩選。剛剛合成的線粒體 DNA是松弛型的，需要 40分鐘將其變成超螺旋型 ? 考察基因功能的常用方法 突變體的表型變化 突變型可分為二類：一類為可以補(bǔ)償?shù)模? 另一類為不可補(bǔ)償?shù)模? ? 考察復(fù)制有關(guān)酶的常用突變型 溫度敏感突變體 此突變體屬于條件致死突變型，即：在 25℃正常生長(zhǎng)， 42℃ 不能生長(zhǎng)致死。 ? ： H鏈的合成提前完成， L鏈的合成隨后結(jié)束。但有時(shí)這個(gè)片段會(huì)繼續(xù)合成，這需要依靠拓?fù)洚悩?gòu)酶和螺旋酶的作用將雙鏈打開(kāi)。合成這樣 500600bp長(zhǎng)的 DNA片段不會(huì)引起線粒體 DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的明顯改變。端位置是固定的，而由于 539。端終止的位置不定而長(zhǎng)短不一 。該片段與H鏈以氫鍵結(jié)合，將親代的 L鏈置換出來(lái)，產(chǎn)生 D環(huán)復(fù)制中間物。 D環(huán)復(fù)制的特點(diǎn)是兩條鏈的復(fù)制不是同步的。 dNTP DNApol γ ? 復(fù)制過(guò)程 ? 在研究真核細(xì)胞內(nèi) 線粒體 DNA的復(fù)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)了 DNA的 D環(huán)復(fù)制。 最后完成兩個(gè)雙鏈環(huán)狀 DNA的復(fù)制 。mtDNA為雙鏈 ， 第一個(gè)引物以內(nèi)環(huán)為模板延伸 。 ? mt（ 線粒體 ） DNA進(jìn)行 D（ displaced loop） 環(huán)復(fù)制 。 ? 質(zhì)粒 R6K早期為單向復(fù)制 ， 復(fù)制了約 1/5基因組時(shí)進(jìn)行雙向復(fù)制 。 ? 枯草桿菌有固定的起始點(diǎn) ， 雙向不對(duì)稱復(fù)制 。 復(fù)制的特點(diǎn)： ? 、 雙向?qū)ΨQ復(fù)制 。 復(fù)制子 （ replicon） ：從復(fù)制起點(diǎn)到復(fù)制終點(diǎn)這樣一個(gè) 完整的 DNA單位稱為復(fù)制子 。 2. 用噬菌體插入標(biāo)記法 同步培養(yǎng) 不同步培養(yǎng) 3. 變性定性法 4. 雙向電泳法 二、原核的復(fù)制起點(diǎn)和方向 復(fù)制起點(diǎn) （ origin,ori） ： DNA分子上特定的發(fā)動(dòng)復(fù)制 的起始位點(diǎn) 。 第一節(jié) 半保留復(fù)制的驗(yàn)證 半保留復(fù)制：親代 DNA的兩條鏈解開(kāi) ， 每條鏈都作為模板形成兩個(gè)子代 DNA分子；新合成的每個(gè)子代 DNA分子中 ， 一條鏈來(lái)自親代 DNA分子 ， 另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?。 第三章 DNA的復(fù)制 復(fù)制（ replication）：是指以原來(lái)的 DNA分子作為模板合成出相同分子的過(guò)程。 ? 復(fù)制在保持生物穩(wěn)定性方面起重要作用； ? 復(fù)制是細(xì)胞分裂的前提和基礎(chǔ)； ? 復(fù)制是精確的復(fù)制，一般不會(huì)差錯(cuò)； ? 復(fù)制方式為半保留復(fù)制（ semiconservative replication）。 ? 半保留模型 （ semioconservetive model） ? 全保留復(fù)制模型 (conservetive model) ? 分散模型 (Dispersive model) 半保留復(fù) 全保留復(fù) 分散模型 制模型 制模型 15N 15N 15N 15N 15N 15N 第一次復(fù)制 1 4N 15N 15N14N 15N 15N 14N14N 14N 14N 15N 15N 15N 15N 14N 14N 第二次復(fù)制 圖 1 1 1 三種不同的復(fù)制模型 驗(yàn)證半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn) ? MeselsonStahl實(shí)驗(yàn) ? Taylar實(shí)驗(yàn) ? 姐妹染色單體差別染色方法 ? Cairns復(fù)制模型 — θ型復(fù)制 第二節(jié) 復(fù)制的起點(diǎn)、方向和終點(diǎn) 一 . 研究方法： 1. 用同位素標(biāo)記電鏡觀察： 1973年 R. L. Rodrigue等提出的，驗(yàn)證了 E. coli環(huán)狀 DNA是雙向復(fù)制，一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，且終點(diǎn)在起點(diǎn)對(duì)面。 復(fù)制終點(diǎn) （ terminus） ： DNA分子上復(fù)制終止的位點(diǎn) 。 ? 原核細(xì)胞基因組實(shí)質(zhì)為一條雙鏈 DNA分子 ， 作為一個(gè)復(fù)制子 ， 整個(gè)基因組的復(fù)制起始于單一位點(diǎn) （ 起點(diǎn) ） ； ? 真核細(xì)胞基因組龐大 ， 有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制終點(diǎn) ，含有多個(gè)復(fù)制子 。 ? T7（ 噬菌體 ） 在近一端的 17％ 處開(kāi)始 ， 向兩端延伸 。 一側(cè)復(fù)制基因組的 4/5， 另一側(cè)只復(fù)制 1/5， 終點(diǎn)也不在 Ori的對(duì)面 。 ? 質(zhì)粒 Col E1有固定起始點(diǎn) ， 但卻為單向復(fù)制 。 8 ? D環(huán)復(fù)制時(shí)需合成引物 。至第二個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)時(shí) ，又合成另一個(gè)反向引物 ，以外環(huán)為模板進(jìn)行反向的延伸 。 復(fù)制中呈字母 D形狀而得名 。復(fù)制過(guò)程四階段。 ? ：在復(fù)制起點(diǎn)處以 H鏈為模板，合成 ─ RNA引物，然后由 DNA聚合酶 γ催化合成一個(gè) 500600bp長(zhǎng)的 H鏈片段。新的H鏈 DNA片段由于分子 339。也有一些 339。端被降解而使整個(gè) DNA片段長(zhǎng)短不一。 ? ：上述產(chǎn)生的 H鏈片段由于太短而很容易被擠出去恢復(fù)線粒體 DNA完整的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 ? ：以被置換下來(lái)的親代 L鏈為模板，離 H鏈合成起點(diǎn)60%基因組的位置開(kāi)始合成 L鏈 DNA，合成也需要 RNA引物。線粒體DNA合成速度相當(dāng)緩慢，約每秒 10個(gè)核苷酸，整個(gè)復(fù)制過(guò)程需要 1個(gè)小時(shí)。 第三節(jié) 原核生物復(fù)制的酶系統(tǒng) ? 利用大腸桿菌 溫度敏感突變體 研究與復(fù)制有關(guān)基因 (dna) 一般復(fù)制的過(guò)程包括：起始、延伸和終止 3個(gè)階段。