westernblot精華ppt課件-展示頁(yè)
2025-05-14 18:34本頁(yè)面
【正文】 TriHCl （ PH=） （ PH=） 10%SDS 150ul 50ul 10%APS 150ul 50ul TEMED 15ul 10ul 常用凝膠配置比例 凝膠濃度與蛋白分離范圍 凝膠濃度％ （ W/V） 分離范圍（ KD) 1002022 80500 60400 40200 25150 6100 6以下 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳注意事項(xiàng)： 做膠：防止漏膠、進(jìn)氣泡以及花膠 (水封、插梳子和拔梳子 )。 ? 將細(xì)胞裂解液再離心，收集上清液 ? 測(cè)蛋白濃度（ Bca法） ,統(tǒng)一上樣量 ? 加 loading BUFFER 煮樣 5min10min 蛋白樣品制備的注意事項(xiàng)： 煮沸 515min，以充分變性蛋白，保證蛋白從空間結(jié)構(gòu)變?yōu)橐患?jí)結(jié)構(gòu)（多聚體解散為單聚體，氧化狀態(tài)轉(zhuǎn)化為還原狀態(tài)等）。 細(xì)胞裂解液 ： + +10μl蛋白酶抑制劑 + 10μl 泛酸鈉 + 1μl pepstain ? 有機(jī)溶劑提取法 對(duì)于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。 Western Blot一般流程 ? 蛋白樣品的制備 ? SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳 ? 轉(zhuǎn)膜 ? 封閉 ? 一抗雜交 ? 洗滌 ? 二抗雜交 ? 洗滌 ? 底物顯色 ? 通過(guò)有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白 ? 水溶液提取法 針對(duì)水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。 經(jīng)過(guò) PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。 ? 1975年， Southern建立了將 DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（ NC膜）上，并利用 DNA－ RNA雜交檢測(cè)特定的 DNA片段的方法
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