凝膠電泳ppt課件(2)-展示頁
2025-05-11 12:02本頁面
【正文】 Well 25 ng 1 kb ladder % Agarose 1 2 4 6 8 10 12 kb Agarose Gel Electrophoresis EtBr Detection Limit: ~510 ng DNA Agarose gel electrophoresis Agarose gel electrophoresis 【 注意事項(xiàng) 】 ? 1. 瓊脂糖融化時，檔位不宜太高。 ?分為常熔點(diǎn)的瓊脂糖和低熔點(diǎn)（ LMP）瓊脂糖。 ， 電泳后必須立即固定染色 。 ， 可直接利用紫外光吸收法作定量測定 （ 二 ） 缺點(diǎn) ， 易破碎 ， 濃度不能太低 。 ， 孔徑較大 ， 可用來分離酶的復(fù)合物 、 核酸 、 病毒等大分子物質(zhì) 。 ?半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖鏈依分子內(nèi)和分子間氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。 ? 6 瓊脂糖種類 常見的有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖； ?凝膠電泳的分辨力： ? 與凝膠的類型和密度相關(guān) ? 瓊脂糖凝膠的分辨力在 ～ 50Kb之間 。 ? 4 凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠 溴化乙錠（ EB）插入雙鏈 DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增加。根據(jù)核酸分子大小不同、構(gòu)型或形狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。第二節(jié) 基因操作的主要技術(shù)原理 ?凝膠電泳 ?擴(kuò)增原理 ?分子雜交 ?DNA測序 ?生物芯片 一、凝膠電泳 ? 它是一種分析鑒定重組 DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，同時也是分子生物學(xué)研究方法的技術(shù)基礎(chǔ)。 ?瓊脂糖凝膠電泳 ?聚丙烯酰胺凝膠電泳 ?脈沖電場凝膠電泳 基本原理 ? 帶有負(fù)電荷的 DNA或 RNA核苷酸鏈，依靠無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的介質(zhì)（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液， 在電場中以一定的遷移率從負(fù)極移向正極 。 DNA的遷移速率決定因素 ? 1 DNA分子的大小 雙鏈 DNA分子遷移的速率與其堿基對數(shù)的常用對數(shù)近似成反比； ? 2 瓊脂糖濃度 濃度越低，相同核酸分子遷移越快； ? 3 DNA的構(gòu)象 一般同一分子：超螺旋環(huán)狀＞線狀＞切口環(huán)狀。 ? 5 所用的電壓 低電壓時 DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。 ? 聚丙烯酰胺的分辨力在 1～ 1000bp之間 Separation Range Vs. % Agarose Low Geling Agarose 46 不同類型瓊脂糖的性質(zhì) 瓊脂糖類型 凝結(jié)溫度 /℃ 熔化溫度 / ℃ 標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖 35~38 90~95 不同廠家生產(chǎn)的不同商品其凝結(jié)溫度和熔化溫度有一定差異 40~42 85~90 高強(qiáng)度瓊脂糖 34~43 85~95 修飾的低熔點(diǎn) / 凝點(diǎn)瓊脂糖 25~35 63~65 35 65 超低熔點(diǎn) 8~15 40~45 低黏性低熔點(diǎn)瓊脂糖 25~30 70 38 85 30 75 ?Agarose Gel Electrophoresis ? 瓊脂糖（ agarose）是一種從紅色海藻中提取出的線性多糖聚合物。 D半乳糖 3， 6脫水 L半乳糖 瓊脂糖凝膠的特點(diǎn) （ 一 ） 優(yōu)點(diǎn) ， 幾乎消除了瓊脂的電滲 ， 故無拖尾現(xiàn)象 。 ， 可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色 。 ， 不易保存 ， 臨用前配制 。 PAGE相比 ， 分子篩作用小 ， 區(qū)帶少 。 ?（ 1） LMP瓊脂糖 ? 熔點(diǎn)： 62～ 65℃ ? 熔解后，在 37℃ 可保持液態(tài)數(shù)小時；在 25℃ 可保持液態(tài)約 10min ?回收 DNA操作：將凝膠在 65℃ 下加熱數(shù)分鐘，再向液態(tài)瓊脂糖中加入過量酚液抽提 DNA，經(jīng)離心獲得含 DNA分子的上清液，酶切 DNA片段后電泳。 2. 制膠和加樣過程中要防止氣泡的產(chǎn)生。必須戴手套操作，嚴(yán)格注意防護(hù)。 5. 電源接通時，應(yīng)核實(shí)凝膠的方向是否正確。負(fù)極的氣泡比正極多一倍，表示電泳已開始。 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ?Polyacrylamide Gel Electrophoresis ， PAGE 原理 ? 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺 (acrylamide，簡稱 Acr)和交聯(lián)劑 N,N甲叉雙丙烯酰胺 (N,Nmethylenebisacylamide，簡稱 Bis)在加速劑 N， N，N?， N?— 四甲基乙二胺 (N， N， N?， N?tetramethyl ethylenedia mine，簡稱 TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，簡稱 AP)或核黃素 (ribofavin即 vita min B2， C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳 ( polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱 PAGE)。 變性的 DNA在這些凝膠中的遷移率幾乎與其堿基組成及序列完全無關(guān)。 2 非變性聚丙烯酰胺凝膠 用于雙鏈 DNA片段的分離和純化。 用途：制備高純度的 DNA片段。 Home 圖 .1 夾心垂直板電泳槽示意圖 圖 .2 凝膠模示意圖 ? SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE）的原理 ：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。因此可 以利用 SDSPAGE測定
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