dna序列分析ppt課件-展示頁
2025-03-02 16:21本頁面
【正文】 因為測序每個反應讀取的序列是有限的，做長片段 DNA 或基因組測序時，需要選用一定的策略?，F(xiàn)在全自動測序仍然沿用 Sanger 氏酶學法，但是在標記上作了改進。 Fred Sanger 發(fā)明的 末端合成終止法 (sanger法 ) Walter Gilbert發(fā)明的 化學裂解法 MaxamGillbert法 基因測序技術(shù) 他們給 DNA 的測序帶來了一場革命，分享了 1980年的諾貝爾化學獎。 末端終止法 化學裂解法 DNA測序自動化 使用特異性引物與單鏈模板 DNA退火，在DNA聚合酶作用下進行延伸反應，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長度僅相差 1個核苷酸的 ssDNA，從而完成測序的方法。 類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標記，計算機自動讀出。 不需酶促反應，可以對寡核苷酸測序。 測序的常用方法 第一節(jié) MaxamGilbert 化學降解法 1977年， . Maxam 和 W. Gilbert 首先建立了 DNA 片段序列的測定方法。 該方法是用特定的化學試劑修飾不同的堿基，并在相應堿基處切斷 DNA片段而進行系列分析的。 MaxamGilbert 化學降解法測序原理圖 ? 將一個 DNA 片段的 5‘ 端磷酸基作放射性標記 . ?分別采用不同的化學方法修飾和裂解特定堿基，從而產(chǎn)生一系列長度不一而 5‘ 端被標記的 DNA 片段 . ?這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過凝膠電泳分離，再經(jīng)放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的 DNA 的堿基序列。 2） 堿性磷酸酶處理消除 5’磷酸。 4） 使標記片段變性為單鏈。（使得平均每 1個DNA分子只有 1個位置被斷裂，這種斷裂是隨機的，如 G反應，則在 DNA鏈上任意位置 G斷裂）， DNA鏈上每 50100堿基只有 1個被裂解，這樣，每個反應中雖然都在同一核苷酸處斷裂 DNA鏈，但由于堿基位置不同，產(chǎn)生 1組不同長度的 DNA片段。 6） 電泳 7） 放射自顯影 8） 4個反應管統(tǒng)一閱讀， DNA4個堿基每個位置都有一個相應的片段，待測 DNA全部核苷酸序列就可直接讀出。 MaxamGilbert 法所用的化學技術(shù) 堿基 特異修飾方法 G ,用硫酸二甲酯對 N7進行甲基化 ,使 C8C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性。 C+T 肼可打開嘧啶環(huán) ,后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去。 化學法測序?qū)嵗? 哌啶 堿基體系 化學修飾 試劑 化學反應 斷裂部位 G A + G C + T C A C 硫酸二甲酯 哌啶甲酸（ ） 肼 + NaCl（ ） 90?C, NaOH（ ） 甲基化 脫嘌呤 打開嘧啶環(huán) 打開胞嘧啶環(huán) 斷裂反應 G G和 A C和 T C A和 C 三、 化學修飾試劑 表： MaxamGilbert化學降解法測序的常用化學試劑 堿基特異性修飾及裂解 反應體系 堿基修飾試劑 堿基修飾反應 主鏈斷裂試劑 斷裂點 G 硫酸二甲酯 鳥嘌呤甲基化 六氫吡啶 G G+A 甲酸 脫嘌呤作用 六氫吡啶 G和 A C+T 肼 嘧啶開環(huán) 六氫吡啶 C和 T C 肼（加鹽） 胞嘧啶開環(huán) 六氫吡啶 C 表 特異斷裂 4種脫氧核苷酸的方法 作用的堿基 試劑與反應 堿基釋放 DNA斷
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