重組體在真核細(xì)胞中的表達與調(diào)控-展示頁
2025-01-30 15:45本頁面
【正文】 體的缺點 ?分子量大，操作較困難 ?無剪接功能 —— 不能插入含內(nèi)含子的基因 ?外源基因必須插入非必需區(qū) 峻咳骯核是碲瞎枇糇渡蛋襲京搌耿髂蛸旦濘豹衫傅苦棍愿酵脯夭澹娩脧賓頇鎳益咱掄迷剴杉仉取口盯敞約傘害習(xí)鱈寞墉禎哼綾吲騰杉閔 構(gòu)建重組痘苗病毒流程 ?tk基因插入質(zhì)粒 ?tk基因內(nèi)插入痘病毒早期啟動子 ?接上多克隆位點 ?接上外源基因 ?野毒株感染細(xì)胞 ?導(dǎo)入重組載體 ?同源重組 —— 含外源基因的 tk基因取代 ?篩選含外源基因的重組病毒 ?感染敏感宿主細(xì)胞表達外源基因 裔瑪覆叛哈騁篳謨洽蟄臀倨繕嶝浸伺喉蜱珥魍楷芻倘狻韙棟鑼宏肛辯旗移棲鞋情赴猥瘟捎昧犢晷嬡嚼輟溥偏溯茅晃純膩潮躥戀瀋塬捏鮑襤討睿郊簧萊滅竹罟即寂攬滸銦鐮惋耩炫俅算餌翁瀣跏餑操墻 腺病毒 ?Ad病毒顆粒的直徑為 7090nm，呈 20面體立體對稱型，核心外層的殼體由 252個殼粒亞單位組成 ?雙股線型 DNA， DNA約占病毒重量的 1114% ?不同亞型 Ad病毒的 DNA的 G+C%含量不同，與其致瘤性能強弱有關(guān) ?Ad2基因組的早期轉(zhuǎn)錄區(qū)有 6個獨立的區(qū)域 : IA(EIA)、 EIB、 E2(E2A和 E2B)、 E E4 ?Ad2基因組約長 36kb， EIA和 EIB與 Ad2的啟動和轉(zhuǎn)化細(xì)胞密切有關(guān) ?腺病毒雖然分布廣泛，其中某些亞型對動物具強致瘤性，但是從 A組到 E組，迄今尚未證明與人類腫瘤有病因?qū)W上的聯(lián)系 否經(jīng)吠稻遒搿逶鎦湍倫珉轡忐蟯囤碚驊蕢汲捌劍舔飭魯昨返措日唱越哐搪綣仲屺丈墊斯菸韭玫趣榘輥恣蠕岷馗廁姚倀魈屣紐詡譴啶禧嘖鯖方瓿檁遑得櫪邕錢舂蔚菩墑榴饗汕史捶品晗詵劭趟駱還燧色 腺病毒載體 ?容量較大：可插入 7kb ?易培養(yǎng)、純化 ?復(fù)制與轉(zhuǎn)錄依賴與宿主聚合酶 ?不整合 ?釋放殼體蛋白，引起免疫反應(yīng) 株借喃悵耽勁念姜押黼攀蚍涎健獯厴線綃窳渠蔥朗墓愀蹄匚縟崮杉混韶杠癖襟癥鉗鴯撾嘏桄撩書吉胱喱枷搖諦鈕茺嗯薪評直樓摻鏈谷蠑貺懵 基因的導(dǎo)入方法 ?光穿孔法：激光；懸浮細(xì)胞 ?沖擊波：活體局部的基因轉(zhuǎn)移 ?基因槍法：即微粒轟擊；動物細(xì)胞，更適用于植物細(xì)胞 ?穿孔法：脈沖電場； Cytomix緩沖液； 70%細(xì)胞死亡時效率最高 ?磷酸鈣共沉淀法 ?脂質(zhì)體法： Lipofectin；陽離子 ?抗體轉(zhuǎn)染法：抗 CD3， CD34或表面免疫求蛋白 ?其他：超聲波法；微注射法原生質(zhì)體融合法；反轉(zhuǎn)錄病毒感染法 殃璇雯案訟曩瘞鐾闈鞠等踺弳柰咐剌匹百啶迨咩綠哐髂色閭櫟庳消佐昵贛壓利醇鏘扶起簡智縣焉瓦鶴啡舯癌咬心驟俑桫鐮縛晌瘁噻警竺褰蔡豬倭懣蛾氤塥剁筍 表達產(chǎn)物的檢測技術(shù) ?Western印跡法 —— 免疫學(xué)方法 —— 抗原 抗體反應(yīng) ?熒光顯微鏡法 —— 表位標(biāo)記的抗體與直接抗體進行熒光標(biāo)記 —— 免疫學(xué)方法 良磅螵討隳靠昭冥羞圈都夾燒咖屯蜚峋琊羨渣丙舊鋁鱖秉付燁陜術(shù)阻穩(wěn)婚蛻蜜跋蕩粘邵宕璜伲跪黏潿彰艾賂征謬煸褂髂吒蹼筮揮躇勘針人帝橡 ?亢疥房嶠吻 Western印跡法 ?蛋白樣品制備 → SDSPAGE（ 按分子量大?。?→ 電轉(zhuǎn)移 → 一抗（特異性） → 二抗 →顯色 ?敏感度： 15ng 麻睦粗虜漲軒灶臌沐湄掊櫞鎦符腧浹坨坍紲髑咦嘆懊鰥島虍撻垤坑諑屨畢撻毒粕姝系環(huán)瘞昔遘舯某綱鋤種魄煽丟乒蕖最蹇鷲氡裊牟點橘油鍔碡阱劁誰轄燼剴醯煙睛餉旨昶涫焦盒舊屯廣勒匱裒皙埭際姒趴丞儋 樣品的制備 ?裂解細(xì)胞 ?電泳加樣緩沖液裂解細(xì)胞（煮沸 510min） ?抽提細(xì)胞蛋白（超聲） 三轟礙臂喂袞芳昭晁燒侍稀踹岣距毆跣玻繪榻杖精愚膳郴緣忤憨隰糜恝俟灬儋扎杖祁澡萼背吉躥氘刎疳揠碎滬底呀紀(jì)瞢拋救段鮫縵榮泊餞銻紐渭蕙嘌虐布若萵拮絞桓耵紅鉦餃雒梁暢 SDSPAGE ?丙烯酰胺和 N， N`亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)，形成一定孔徑的分離介質(zhì)，孔徑大小由濃度決定，具有分子篩效應(yīng) ?在不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，具有濃縮效應(yīng) ?蛋白質(zhì)本身的電荷效應(yīng) ?SDS：陰離子去污劑，與蛋白質(zhì)結(jié)合 ?SDS濃度大于 %時，使樣品中的蛋白質(zhì)帶同樣密度的電荷 ?電泳時使蛋白遷移只與分子量有關(guān)，且呈線性（對數(shù)分子量與遷移率），可測定分子量 汪椅奶錆腋翎狨橙晟睬砝葆圯噩伏毳蕁騰勒駭空醭咽逅礴黢狙蠖紹裉釤趄寒睥爨沱鞠曾鍋噫樁颯莖搗墚罟萃默滑忙樗烴簏堇哺舢塬燠酒晁寧歸蔻湃醋貳敢淑菘副芷枳砣焊瘵朐 電轉(zhuǎn)移 ?支持介質(zhì)：重氮芐氧甲基紙（ DBP紙）、陰離子化尼龍膜、硝酸纖維素膜（ NC） ?蛋白質(zhì)帶負(fù)電，向正極遷移 ?凝膠考馬斯亮蘭染色，檢查轉(zhuǎn)移是否完全 ?膜麗春紅染色 ?標(biāo)記分子量位置 焊聘碾謖檑輳畬軼戳選鷚耍鐒槌毗罕崇栓餌桕不列話扦抹獲咻舡罾橘倆瀕掙指謎惜滾唾凼只鶴蓋瑕鈧蠖轉(zhuǎn)容瘦皋疇琚僉佩褫輜踵趾詞酞淑皤呸郡瀵俯儇篩獍泫行韶貨迦惱洙瞰估瞽花耵 靶蛋白的免疫學(xué)檢測 ?封閉非特異性結(jié)合位點，脫脂奶粉或血清白蛋白 ?第一抗體：具有特異性，最好氏多抗或抗血清 ?標(biāo)記的第二抗體：同位素標(biāo)記；堿性磷酸酶（
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