植物細(xì)胞工程2中國(guó)藥科大學(xué)生物工程所有-展示頁(yè)
2025-01-27 01:43本頁(yè)面
【正文】 胞團(tuán) 篩選 再生雜合細(xì)胞 PEG結(jié)合高鈣 高 pH誘導(dǎo)法 電融合法 二、原生質(zhì)體融合的過(guò)程 ? 包括 3個(gè)主要階段： 凝聚作用階段，其間兩個(gè)或兩個(gè)以上的原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近 在很小的局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合，在兩個(gè)原生質(zhì)體之間細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)連續(xù)狀態(tài)，或是出現(xiàn)橋 由于細(xì)胞質(zhì)橋的擴(kuò)展，融合完成，形成球形的異核體或同核體。 粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連 ， 電荷的重排隊(duì)導(dǎo)致一個(gè)原生質(zhì)體的負(fù)性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導(dǎo)致融合 。 高 pH高 Ca離子法 PEG法 特點(diǎn)： 融合頻率高 可重復(fù)性強(qiáng) 誘發(fā)融合無(wú)特異性 毒性較低 植物 +植物 植物 +動(dòng)物 動(dòng)物 +酵母 PEG法 PEG法 原理 PEG是一種帶負(fù)電性的高分子化合物 ， 在原生質(zhì)體融合中起到一種橋梁作用 ， 可以使原生質(zhì)體凝聚。 優(yōu)點(diǎn)：雜種產(chǎn)量高。 NaNO3的作用： 中和質(zhì)膜的負(fù)電荷，使原 生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起 不足：誘導(dǎo)頻率不高。 原生質(zhì)體活力測(cè)定 目測(cè)法 活體染色法 熒光染料活體染色法 第五節(jié) 植物細(xì)胞融合技術(shù) （體細(xì)胞雜交） ?在外界因素作用下，使兩個(gè)或兩個(gè)以上植物細(xì)胞合并成一個(gè)多核細(xì)胞的過(guò)程。 酶處理 ? 纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶 酶解時(shí)間 酶濃度 酶解溫度 酶處理效果 在分離原生質(zhì)體的酶溶液內(nèi)，需加入一定量的滲透穩(wěn)定劑，其作用是保持原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定，避免破裂。第四節(jié) 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù) 除去纖維素外壁且具有生活力的裸體植物細(xì)胞稱之為植物原生質(zhì)體。 影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的因素 材料的來(lái)源 前處理 酶處理 滲透壓 材料的來(lái)源 ? 葉片 ? 愈傷組織 ? 培養(yǎng)細(xì)胞 A、材料用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射 B、消毒 C、保證酶解充分進(jìn)行，促使酶溶液滲入到葉片的細(xì)胞間隙中。 糖溶液系統(tǒng) 鹽溶液系統(tǒng) ? 機(jī)械法 ? 酶消化法 原生質(zhì)體分離 A、兩步法分離植物原生質(zhì)體 先用果膠酶離析植物組織，使植物細(xì)胞從組織中分離出來(lái)，然后收集細(xì)胞洗滌后用纖維素酶解離細(xì)胞壁獲得原生質(zhì)體 B、一步法分離 把一定量的纖維素酶和果膠酶組成混合酶液，對(duì)材料進(jìn)行一次性處理。 Fusion phases of oat protoplasts (Avena sativa) 1978年德國(guó)科學(xué)家梅歇爾斯等人把馬鈴薯 (potato)和番茄 (tomato)的原生質(zhì)體融合獲得了體細(xì)胞雜種 “泡馬豆 ” （ pomato) 一 、誘導(dǎo)融合的方法 無(wú)機(jī)鹽誘導(dǎo)融合 高 pH高 Ca離子 聚乙二醇 (PEG)法 PEG結(jié)合高鈣 高 pH誘導(dǎo)法 電融合技術(shù) 無(wú)機(jī)鹽 誘導(dǎo)融合 : NaNO3法 ? 1972年： Carlson誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合獲得首例雜種植株粉藍(lán)煙草和朗氏煙草體細(xì)胞雜種。 1973年： Keller用 50 mM CaCl2溶液在 37℃時(shí)，誘發(fā)煙草葉肉原生質(zhì)體融合。 不足：高 pH值對(duì)細(xì)胞有毒害作用。 在洗脫過(guò)程中 ， PEG將被洗掉 ， 導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷重排 。 + + 橋梁 + + PEG被洗掉 + + 電荷重排 + + 原生質(zhì)體膜接觸 + + 融合 示意 圖 最為常用。 三、雜合體的鑒別與篩選 （一）雜合細(xì)胞的顯微鏡鑒別 （二）互補(bǔ)法篩選雜合細(xì)胞 （三）采用細(xì)胞與分子生物學(xué)的方法鑒別雜合體 （四）根據(jù)融合處理后再生長(zhǎng)出的植株的形態(tài)特征進(jìn)行鑒別 遺傳互補(bǔ)篩選法： 利用每一親本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細(xì)胞
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