生物化學(xué)實驗堿性磷酸酶的分離提取及比活力的-展示頁
2025-01-25 12:49本頁面
【正文】 ? 在蛋白質(zhì)或酶的分離提取過程中由于酶蛋白容易變性而失活，為了獲得較好的分離提取效果，在工作中特別注意以下幾點： (1) 取用新鮮的材料，提取工作應(yīng)在獲得材料后立刻開始，否則應(yīng)在低溫下保存。 (2) 用鹽分級沉淀是一種應(yīng)用非常廣泛的方法。 (3) 在酶的制備過程中，每經(jīng)一步處理，都需測定酶的活力和比活力。 ? 酶活力的分析：通常是以對 硝基苯磷酸二鈉（ pNPP）為底物，在 （含 2 mmol/L Mg2+）的測活體系中檢測酶催化 pNPP水解產(chǎn)生黃色的對硝基苯酚（ pNP）的量。 ? 酶活力定義為：在 37℃ 下，以 2 mmol/L pNPP為底物，在 2 mmol/L Mg2+的測活體系中每分鐘催化產(chǎn)生 1 ?mol/L pNP的酶量定為 1個酶活力單位。 ? 蛋白質(zhì)濃度的測定常采用福林 酚試劑（ FolinPhenol reagent）顯色法 3 操作方法 牡蠣堿性磷酸酶的分離提取 (1) 每組稱取 20 g牡蠣（蒸餾水洗凈），加入 50 mL預(yù)先冷卻的 mol/L TrisHCl 緩沖液（ pH ，含 mol/L NaCl）， （兩組一起） 于高速組織搗粹機勻漿 1 min，于冰箱 4℃ 放置 1 h進(jìn)行抽提。（留 2 mL上清液，待測酶的比活力。緩慢加入，不斷攪拌溶解，置冰箱靜置 1 h。（留 2 mL上清液，對 mol/L TrisHCl 緩沖液 pH mol/L NaCl 透析平衡，待測酶的比活力。緩慢加入，不斷攪拌溶解，置冰箱靜置 2 h。 (7) 得到沉淀物，溶于 5 mL含 mol/L NaCl 的 mol/L TrisHCl pH 。 (8) 取出酶溶液，冷凍高速離心（ 0℃ 25000 r/m 30 min）。裝入棕色瓶于 4℃ 冰箱保存。 室溫離心， 40
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