【正文】 。 ◆ 步驟 : ◇ 材料的選擇與預(yù)處理 31 ◇ 細(xì)胞破碎 ◇ 抽提 :低溫 , 緩沖溶液 , ◇ 分離與提純 : 方法有鹽析、有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀、離子交換法等 注意 : 操作應(yīng)在低溫條件下 。 28 ◆ 按 合成特點(diǎn) 分： ◇ 組成酶 (結(jié)構(gòu)酶 ): ◇ 誘導(dǎo)酶 :在誘導(dǎo)時(shí)合成的酶 ◆ 按 作用位點(diǎn) 分： ◇ 胞內(nèi)酶：包括結(jié)合酶和溶酶 ◇ 胞外酶 : 29 ◆ 酶的 組成 分類 ◇ 簡(jiǎn)單蛋白酶 (單成分酶 ): 只由蛋白質(zhì)成分，由蛋白質(zhì)起催化功能 ◇ 結(jié)合蛋白酶 (雙成分酶 ): 除蛋白質(zhì)部分外 ， 還含有非蛋白組分的這種酶 ， 也叫全酶 (holoenzyme)。 ◇ 多酶復(fù)合體 (multienzyme plex)： 是由幾種酶彼此嵌合形成的復(fù)合體，能催化一系列反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行。 NH3 + Glu + ATP ? Gln + ADP + Pi + H+ 26 3 其它習(xí)慣歸類命名法 ◆ 按 酶蛋白 (催化反應(yīng)時(shí)的組合方式） 分 ◇ 單體酶 (monomeric enzyme): 只有一條肽鏈組成，大多數(shù)屬于水解酶類，如蛋白酶、胰蛋白酶、核糖核酸酶、 溶菌酶等。 因而通常有 ATP等高能物質(zhì)參加反應(yīng) 。 催 化 分 子 內(nèi) 基 團(tuán) 的 易 位H OOHHH OHHO HHO HOH OOHHH OHHO HHOO HP O HOO HPOO HO H25 ◇ 第六大類 :合成酶類 (synthetase)或 連接酶(ligases)。 催 化 醛 基 和 酮 基 的 互 變HC H OO HHO HO HHO HHH2P3O H2CC H2O HOHO HO HHO HHH2P3O H2C磷 酸 己 糖 異 構(gòu) 酶2 。 23 ◇ 第五大類 : 異構(gòu)酶類 （ isomerase) 催化各種同分異構(gòu)體 (即分子式相同，而結(jié)構(gòu)式不同的化合物 )間的相互轉(zhuǎn)變 , 即促進(jìn)分子內(nèi)部基團(tuán)的重新排列 , A = B 包括幾種不同類型： ▽ 異構(gòu)酶 ：如葡萄糖 6磷酸異構(gòu)酶， G6P到 F6P。 裂解反應(yīng)大多是從底物上移去一個(gè)基團(tuán)而形成雙鍵的反應(yīng)或其逆反應(yīng)。 如： 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (GlutamatePyruvate transaminase, GPT）：催化氨基從 Ala轉(zhuǎn)到 a酮戊二酸的酶。 乙醇脫氫酶：催化乙醇脫氫 乙醇 :NAD+ 氧化還原酶 () 20 ◇ 第二大類 : 轉(zhuǎn)移酶類 (transferase) 催化分子間基團(tuán)的轉(zhuǎn)移，通式： A若底物是水時(shí)可以略去。 16 2 系統(tǒng)命名 ◆ Enzyme Commission(酶學(xué)委員會(huì) ,EC)： 酶的名稱應(yīng)明確表明：酶的底物及催化反應(yīng)的性質(zhì)。 慣用命名法比較好命名 ,但缺乏系統(tǒng)性 。 15 ◆ 根據(jù)酶的 來(lái)源 命名。 ◆ 根據(jù)催化的 反應(yīng)性質(zhì) 命名，如催化脫氫的酶叫脫氫酶，催化轉(zhuǎn)氨基作用的酶叫轉(zhuǎn)氨酶。 ▽ 幾何異構(gòu)專一性 ：延胡索酸酶只作用于延胡索酸 (反 丁烯二酸 ), 而不能作用于順 丁烯二酸。 11 酶專一性 結(jié)構(gòu)專一性 立體異構(gòu)專一性 相對(duì)專一性 絕對(duì)專一性 鍵專一性 基團(tuán)專一性 旋光異構(gòu)專一性 幾何異構(gòu)專一性 12 ◇ 結(jié)構(gòu)專一性 ：對(duì)底物分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的特殊要求 ▽ 絕對(duì)專一性 : 只作用于一種底物（脲酶只作用于尿素） ▽ 相對(duì)專一性 : 作用于一類化合物或一種化學(xué)鍵 . * 鍵專一性 :如酯酶 , COOR * 族專一性 (基團(tuán)專一性 ): 胰蛋白酶只水解 Lys、 Arg的 COOH參與的肽鍵。 酶的專一性實(shí)質(zhì)上是 酶分子對(duì)底物分子的識(shí)別 。除去輔因子后酶失去活性。 9 ◆ 酶的催化效率高 酶催化反應(yīng)的反應(yīng)速度比催化反應(yīng)的速度要高1081020倍 ◆ 易變性 使蛋白質(zhì)變性的理化因素 (強(qiáng)酸、 強(qiáng)堿、重金屬、高溫、紫外線、超聲波、劇烈振蕩等 )均可影響其活性。 8 2 作為生物催化劑的特點(diǎn) ◆ 酶是蛋白質(zhì)組成 ， 具有蛋白質(zhì)的一切屬性 。 ◆ 都能降低反應(yīng)所需要的活化能。 7 二 酶作用的特點(diǎn) 1 與一般催化劑的共性 ◆ 在反應(yīng)前后本身不發(fā)生質(zhì)和數(shù)量上的變化。 ◆ 生物細(xì)胞都產(chǎn)生自己所需的酶 。此抗體能使酯的 水解反應(yīng)加速 1000倍 。 位到抗原分子的表面 , 這種現(xiàn)象類似于酶與底物 誘導(dǎo)契合 。 3 脫氧核酶 ：具催化活性的 DNA。1 第四章 酶和輔酶 第一節(jié) 概述 第二節(jié) 酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)與催化活性 第三節(jié) 酶的作用機(jī)理 第四節(jié) 影響酶促反應(yīng)的因素 第五節(jié) 酶工程簡(jiǎn)介（自學(xué)） 第六節(jié) 維生素和輔酶 本章重點(diǎn)和難點(diǎn)、復(fù)習(xí)思考題 2 一 酶的概念 二 酶的作用特點(diǎn) 1．與一般催化劑的共性 2．作為生物催化劑的特點(diǎn) 三 酶的分類與命名 1．習(xí)慣命名 2. 系統(tǒng)命名 第一節(jié) 概述 3. 其它習(xí)慣歸類命名法 四 酶分離提純與活力測(cè)定 1. 分離提純 (自學(xué)） 2. 酶活力測(cè)定 3 一 酶的概念 1 1926年 , Summer: 脲酶結(jié)晶 → 酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的具有特殊催化能力的蛋白質(zhì)，是生物催化劑。 2 擬酶 (核酶 ): 1981年， Cech(USA)發(fā)現(xiàn)四膜蟲的 rRNA前體有催化活性，自我剪切和拼接形成有生物功能的 26S rRNA。 4 The Nobel Prize in Chemistry 1989 for their discovery of catalytic properties of RNA Sidney Altman Thomas R. Cech 1/2 of the prize 1/2 of the prize Canada and USA USA Yale University New Haven, CT, USA University of Colorado Boulder, CO, USA b. 1939 b. 1947 5 4 抗體酶 (abzyme,催化抗體 )： 一類具催化能力的免疫球蛋白稱為抗體酶或催化抗體 。 Tramontano 等用一種在結(jié)構(gòu)上與某些酯類水解反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)相似的化合物用為半抗原制備單克隆抗體。 6 一般認(rèn)為： ◆ 酶是生物體內(nèi)活細(xì)胞產(chǎn)生的 、 能催化熱力學(xué)上允許進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)的催化劑 化學(xué)本質(zhì) ：絕大多數(shù)為蛋白質(zhì) ， 少數(shù)為核酸 。 ◆ 生物體中各種代謝反應(yīng)都需特殊的酶參加。 ◆ 能加速反應(yīng)達(dá)到平衡點(diǎn)，但不改變平衡 ◆ 只能催化熱力學(xué)上允許發(fā)生的化學(xué)反應(yīng) , 不能催化本身不能發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。 ◆ 用量少而效率高。 能使蛋白質(zhì)變性的因素如高溫 、 強(qiáng)酸 、 強(qiáng)堿 、重金屬離子 、 紫外光等因素都會(huì)使酶喪失活性 ,而無(wú)機(jī)催化劑在高溫等條件下也不失效 。 ◆ 酶活性的可調(diào)節(jié)性 ◆ 有些酶的 催化活性與輔因子有關(guān) 。 10 ◆ 作用底物的專一性 /特異性 : 酶對(duì)其作用的物質(zhì) (底物 、 substrate)有嚴(yán)格的選擇性 。 不同的酶所表現(xiàn)的專一性在程度上有很大的差別 ， 主要取決于 酶的活性中心的構(gòu)象和性質(zhì) 。 13 ◇ 立體異構(gòu)專一性 : 對(duì)底物化學(xué)結(jié)構(gòu)的立體構(gòu)型有要求和選擇 . ▽ 旋光異構(gòu)專一性 : L氨基酸氧化酶只能氧化 L氨基酸。 酶作用的專一性機(jī)理 14 三 酶的分類與命名 1 習(xí)慣命名 ◆ 根據(jù)作用的 底物 命名 ,如淀粉酶分解淀粉、酯酶分解酯等。 ◆ 根據(jù) 底物及催化的反應(yīng)性質(zhì) 命名 .如琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸脫氫氧化。 來(lái)源于胃的蛋白酶叫 胃蛋白酶 ，來(lái)源于胰臟的叫胰蛋白酶。酶常常重復(fù) ， 一酶多名或一名多酶 。 包括：底物及反應(yīng)類型 , 若有多種底物都應(yīng)表明 , 用 “ :”分開。名稱最后加一個(gè) “ 酶 ase” 字 如 : 乙醇脫氫酶系統(tǒng)命名為 : 乙醇 :NAD+ 脫氫酶 17 ◇ 6大類 : 6 ◇ 根據(jù)底物中被作用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)，每一大類又可分為若干 亞類 , …… ◇ 每一亞類可分為若干 亞亞類 ， ◇ 酶在亞亞類中的 排號(hào) 酶的分類編號(hào)由 4個(gè)數(shù)字組成 , 每個(gè)數(shù)字間用 “ .”分隔 , 編號(hào)之前都要用 EC. 如 : ◆ 分類與編號(hào) : 18 ◆ 酶的 6大類 : ◇ 第一大類 :氧化還原酶類 ◇ 第二大類 :轉(zhuǎn)移酶類 ◇ 第三大類 :水解酶類 ◇ 第四大類 :裂合酶類 ◇ 第五大類 :異構(gòu)酶類 ◇ 第六大類 :合成酶類 19 ◇ 第一類 : 氧化還原酶類 (Oxidoreductases） 包括 : 脫氫酶 ,氧化酶 ,過(guò)氧化物酶 ,加氧酶 , 羥化酶等。X+B=A+BX 如 氨基轉(zhuǎn)移酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶等 。 21 ◇ 第三大類 :水解酶類 利用水分子使底物分子共價(jià)鍵斷裂 , 即催化水解的酶類 . 通式： RRˊ+ H2O → RH + ROH 如淀粉酶 , 蛋白酶類等 22 ◇ 第四大類 : 裂合酶類 (lyases) 能催化一種化合物分裂為幾種化合物，或由幾種化合物合成一種化合物。 通式為： AB=A+B 包括 : 醛縮酶、水化酶、脫羧酶及脫氨酶等 。 ▽ 易向酶 :催化不對(duì)稱碳原子上的基團(tuán)易向 . ▽ 變位酶 :催化分子內(nèi)基團(tuán)的易位 . ▽ 消旋酶 ： D氨基酸消旋酶使 Daa變?yōu)? Laa ▽ 分子內(nèi)氧化還原酶 ▽ 分子內(nèi)轉(zhuǎn)移酶 24 1 。 催 化 不 對(duì) 稱 基 團(tuán) 易 向H OOHHH OHH OO HHHO HH OOHHH OHHO HHO HO H3 。 催化兩種物質(zhì) (雙分子 )合成一種物質(zhì)的反應(yīng) ， 這種合成反應(yīng)一般是吸能過(guò)程 。 通式可寫成為： A + B + ATP = AB + ADP + Pi (AMP+PPi) 谷氨酰胺合成酶 (GS， glutamine synthetase) 催化谷氨酰胺的合成。 ◇ 寡聚酶 (oligomeric)： 由相同或不相同的兩條以上亞基構(gòu)成的，不是以共價(jià)鍵連接，彼此之間很易分開。例如脂肪酸合成酶、丙酮酸脫氫酶系 . 27 ◆ 按酶含量穩(wěn)定性分 ◇ 恒態(tài)酶 : 參與代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化的基本組成的酶 , 含量一般相對(duì)恒定 , 其活性僅受基本反應(yīng)動(dòng)力學(xué)系統(tǒng)本身和組成因素的調(diào)節(jié) ◇ 調(diào)節(jié)酶 : 在代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化起調(diào)節(jié)作用的酶 , 含量和組成因機(jī)體的機(jī)能狀況而不同 . 如共價(jià)調(diào)節(jié)酶 (酶原激活、磷酸化與脫磷酸化等 )、 別構(gòu)酶、 同工酶、多功能酶。 全酶 = 酶蛋白 + 輔助因子 . 30 四 酶的分離提純及活力測(cè)定 1 分離提純（自學(xué)） ◆ 目的 : 研究酶的理化性質(zhì) (結(jié)構(gòu)、功能、生物學(xué)功能等 )；酶的鑒定；作為生化試劑或藥物。 加入 EDTA螯合劑以防止重金屬使酶失活 。不能過(guò)度攪拌以免產(chǎn)生大量泡沫使酶失活 。 ◇ 保存濃縮的酶液 ,用硫酸銨沉淀或硫酸銨反透析法使其濃縮 . ◇ 冰凍干燥 : 先低溫結(jié)冰再減壓使水分升華 . ◇ 濃縮酶液加入等體積甘油后可于 20℃ 以下較長(zhǎng)時(shí)間保存 . 33 2 酶活力測(cè)定 ◆ 酶活力 (酶活性 , enzyme activity): 酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力 , 通常以最適條件下它所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度來(lái)表示 . 酶催化的反應(yīng)速度