【正文】 ........................... 5 基因的克隆及序列分析 ........................................................................................ 6 基因的克隆 ......................................................................................................... 6 割膠回收 ............................................................................................................. 6 T載體連接 ......................................................................................................... 6 4 結(jié)果與分析 ................................................................................................................... 7 RNA 電泳結(jié)果分析 .............................................................................................. 7 RNA 紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果分析 .................................................................. 7 純化后 RNA 電泳結(jié)果分析 ................................................................................. 8 合成 cDNA 電泳結(jié)果分析 ................................................................................... 8 PSY 基因的克隆 ................................................................................................... 9 序列性分析 ............................................................................................................ 9 5 討論 ............................................................................................................................. 12 參考文獻(xiàn) ........................................................................................................................... 14 致謝詞 ............................................................................................................................... 16 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 化學(xué)與生命科學(xué) 學(xué)院 生物科學(xué)專業(yè) 付文佳（ 05260204） 指導(dǎo)老師 ： 楊莉（副教授） 正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 3 摘要 ： 采用改良 Bugos 法提取紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚成熟果實(shí)果肉 RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。對(duì)本研究提供過(guò)幫助和做出過(guò)貢獻(xiàn)的個(gè)人或集體，均已在文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。9 本科 生 畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 題 目： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 學(xué) 院： 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 1 畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）原創(chuàng)性聲明和使用授權(quán)說(shuō)明 原創(chuàng)性聲明 本人鄭重承諾：所呈交的畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文），是我個(gè)人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的成果。盡我所知，除文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人或組織已 經(jīng)發(fā)表或公布過(guò)的研究成果，也不包含我為獲得 及其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或?qū)W歷而使用過(guò)的材料。 作 者 簽 名： 日 期： 指導(dǎo)教師簽名： 日 期： 使用授權(quán)說(shuō)明 本人完全了解 大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的規(guī)定，即：按照學(xué)校要求提交畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存畢業(yè)設(shè)計(jì)（ 論文）的印刷本和電子版，并提供目錄檢索與閱覽服務(wù)；學(xué)?？梢圆捎糜坝?、縮印、數(shù)字化或其它復(fù)制手段保存論文；在不以贏利為目的前提下，學(xué)?？梢怨颊撐牡牟糠只蛉?jī)?nèi)容。根據(jù) NCBI網(wǎng)站公布的 PSY 基因全序列設(shè)計(jì)引物，采用高保真 Taq聚合酶進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，將擴(kuò) 增產(chǎn)物連接到 pUCmT 載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α， 并送公司測(cè)序。 關(guān)鍵詞 ： 紅肉蜜柚；琯溪蜜柚； PSY 基因；基因分離；序列分析 Isolating PSY Gene from Redfleshed Sweet Pomelo and Its Parent Guanxi Sweet Pummelo FU Wenjia Director: YANG Li (College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, 052 ) Abstract： The total RNA was extracted from the ripe fruit of Redfleshed sweet pomelo and Guanxi sweet pomelo using improved Bugos RNA extraction method, then were synthesised cDNA by reverse transcriptase kit. At the same time, we designed primers for PSY gene sequences according to the information PSY gene sequences on NCBI, highfidelity Taq polymerase were used for PCR amplification and cDNA as the template. Finally, the PCR products were connected to pUCmT vector, then sequenced and analyzed the sequences. Sequence analysis indicated that the cDNA fragment was 1317 bp, encoding a 439 amino acid protein and haved 99 % identity with those of other citrus in the highest level. The researching may be essential for the molecμLar mechanism of PSY gene mutation. Key Words： redfleshed sweet pomelo。 PSY gene。 sequence analysis 1 引言 芽變是體細(xì)胞突變的一種，即突變發(fā)生在芽分生組織細(xì)胞中，當(dāng)芽萌發(fā)長(zhǎng)成枝條，表現(xiàn)出與原來(lái)植株不同的性 狀即為芽變，經(jīng)突變的芽長(zhǎng)成枝條經(jīng)繁育可成為變異單株，是果樹(shù)等多年生作物的一種特殊育種途徑 [1]。 之后，由福建省農(nóng)科院果樹(shù)研究所及平和縣農(nóng)業(yè)局等組成課題組，進(jìn)行新品種的選育、保護(hù)和繁殖工作。正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 4 經(jīng)檢測(cè)：紅肉蜜柚的微量元素比野生型琯溪蜜柚含量更豐富，所含的黃酮類和類胡蘿卜素共同具 有抗癌作用，比其它柚類更具防心臟病，降血脂功效。 近年來(lái)，越來(lái)越多的醫(yī)學(xué)研究表明，除了不少類胡蘿卜素代謝中間產(chǎn)物是維生素 A 的前體外，在猝滅自由基、增強(qiáng)人體免疫力、預(yù)防心血管疾病和防癌抗癌等保護(hù)人類健康方面也起著十分重要的作用 [4]。了解植物類胡蘿卜素積累的特點(diǎn)與代謝的生理機(jī)制，對(duì)于進(jìn) 一步調(diào)控植物類胡蘿卜素的生物合成途徑具有重要的意義。在番茄和油菜等植物中， PSY 被證實(shí)是類胡蘿卜素生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。此外，該基因在成熟葉片中的表達(dá)高于幼葉 [8]。 本實(shí)驗(yàn)擬 分離紅肉蜜柚及其親本 琯溪蜜柚果實(shí) PSY 基 因全長(zhǎng)，比較分析二者序列是否存在差異，以了解 PSY 基因在突變體中的具體功能，為解釋 紅肉蜜柚發(fā)生變異的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ) 。 實(shí)驗(yàn)試劑 試劑 TrisHCl， EDTA， SDS 購(gòu)自北京博大泰克生物有限公司， ?巰基乙醇，DEPC（焦碳酸二乙酯）， Tris 飽和酚， LiCl 購(gòu)自北京鼎國(guó)生物有限公司，內(nèi)切酶 、連接酶， pUCmT， DNase I 載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，高保真 Taq DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物 技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自 Promega 生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)中涉及的引物 由上海賽百盛生物有限公司合成，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。 3 方法 總 RNA 提取 常用試劑配制 ① % DEPC 溶液：在經(jīng)高溫烘烤 4 h 除 RNA 酶的試劑瓶中用 ddH2O 配制成正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 5 % DEPC 溶液， 37 ℃ 放置 12 h 以上， 120 ℃ 高壓滅菌 30 min； ② 2 M NaCl： g NaCl 溶于 100 mL DEPC 處理的 ddH2O， 120 ℃ 高壓滅菌 30 min； ③ M EDTA： g EDTA 溶于 50 mL DEPC ddH2O，用氫氧化鈉固體調(diào)節(jié)pH 至 ， 120 ℃ 高壓滅菌 30 min； ④ 12 M LiCl： g L iCl 加熱溶解于 200 mL DEPC ddH2O， 120 ℃ 高壓滅菌 30min； ⑤ M TrisHCl： g TrisHCl 溶于滅菌過(guò)的 DEPC ddH2O，用濃 HCl 調(diào)節(jié) pH 至 ； ⑥ 3 M NaAc： g NaAc 溶于 30 mL DEPC ddH2O，加冰乙酸調(diào)節(jié) pH 至，定容至 50 mL， 120 ℃ 高壓滅菌 30 min。 器具處理與準(zhǔn)備 ① 塑料制品（包括槍頭、 EP 管等）：用 DEPC ddH2O 浸泡槍頭、 EP 管， 37 ℃放置過(guò)夜， 121 ℃ 高壓滅菌 30 min， 65 ℃ 烘干備用； ② 玻璃制品：清洗干凈， % DEPC ddH2O 處理， 65 ℃ 烘烤 4 h。 提取 RNA 參照徐昌杰等建立的適于柑橘果實(shí) RNA 的改良 Bugos 方法提取成熟紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚果肉總 RNA[10, 11]。 RNA 的純化 DNase I 處理：將提取得到的紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚果肉總 RNA，加 DEPC ddH2O 補(bǔ)足 到 μL，再加入 5 μL 10反應(yīng)緩沖液和 μL DNase I， 于 37 ℃ 保溫 30 min。 RNA 提取質(zhì)量與含量檢測(cè) 總 RNA 的電泳分析 取 1 μL總 RNA 樣品，稀釋 10 倍，于 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察總 RNA條帶情況，凝膠成像，拍照。 cDNA 鏈合成 參照 Promega MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明，所使用引物如下： SMART Oligonucleotide： 539。 339。AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30個(gè) T 堿基 )V N339。 PCR Primer II A： 539。 cDNA 一鏈的合成 具體操作參見(jiàn)表 11，表 12。 SMART CDS primer 539。 PCR Primer II A (10 uM) RNA inhibitor 1 1 MMLV 1 1 42 ℃ 溫育 60 min，轉(zhuǎn)至 72 ℃ 溫育 10 min 后，放置冰上保存。 基因