基因工程基本原理及技術(shù)-文庫(kù)吧資料
2025-01-12 09:58本頁(yè)面
【正文】 ； 。 PH值 。 (2)平末端連接 (blunt end ligate)：目的基因和載體用同一種能產(chǎn)生平末端的酶切割后連接 ， 重組后保留原來(lái)的酶切位點(diǎn) ， 如Smal CCC?GGG 所用酶量要大 . 連接反應(yīng)條件 連接酶的活性 。 用 堿性磷酸酶 (能除掉 DNA5`端 P基團(tuán) ， 使 5`端帶一 OH)處理載體 ， 可防止載體自身環(huán)化 。 （ 1） 粘末端連接 (cohesive end ligate)： （ a） 目的基因和載體 用 同一種限制酶切割 后連接 。一般在適宜的緩沖液和溫度條件下，每微克 DNA用 1~5單位的酶，保溫 1~2小時(shí)。 此外 ， 許多酶反應(yīng)還需要 NaCl ， 但不同的酶對(duì) NaCl的需要量各有差別 。 DNA 的濃度 不宜過(guò)高 ， 高濃度的 DNA 會(huì)使溶液的粘待度增加從而抑制酶分子的擴(kuò)散導(dǎo)致酶切反應(yīng)不徹底 。也不能含有過(guò)高的 EDTA。 概念 ：限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease ) 是指能專(zhuān)一地識(shí)別 DNA分子上特定的堿基序列并將 DNA切斷的內(nèi)切酶。 ori P o LacZ kmram2 （三） .限制性核酸內(nèi)切酶 限制酶是一種必不可少的工具酶，是進(jìn)行DNA分子切割的特殊工具。 主要用于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移 ， 通常是將載體和待克隆的真核生物 DNA片段先在細(xì)菌中克隆 ， 再轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞中表達(dá) ， 并可提高外源基因的表達(dá)效 率 。 7． 穿梭載體 (shuttle vector) 又稱(chēng) 雙功能載體 (bifunctional vector)。常用載體 pUC18 pUC 19. 6． 表達(dá)載體 (expression vector) 使 目的基因在宿主細(xì)胞中得以表達(dá) 的載體 。 一般具有較低的分子量 、 較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子 。這類(lèi)載體有痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒。這類(lèi)載體的代表是 SV40－ PSV系列和逆轉(zhuǎn)錄病毒－逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體 pLPGHL、 pMSV 等。 另外，由于非重組體 cosmid很小，不能在體外包裝 ,因此非重組體的本底很低，利于重組克隆的篩選。 (4)分子小，約 4— 6kb，可容納大至 4050kb的外源DNA片段。cosmid的構(gòu)造特點(diǎn) : (1)含有抗藥標(biāo)志和復(fù)制起始部位。 3. 柯氏質(zhì)?；蚍Q(chēng)粘尾質(zhì)粒 (cosmid) 是指含有入噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒 。 入噬菌體作為克隆載體有 兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)： 1) 轉(zhuǎn)染效率高 :可在體外包裝 ， 產(chǎn)生有感染性的噬菌體顆粒 ， 每個(gè)顆粒都可能感染一個(gè)大腸桿菌 . 2)篩選程序簡(jiǎn)便 :一定長(zhǎng)度的噬菌體才能包裝 . 現(xiàn) 改建的載體類(lèi)型有：插入型載體如 λgt11。 天然的質(zhì)粒不能具備以上所有條件 ， 所以實(shí)際應(yīng)用的都是人工構(gòu)建的質(zhì)粒 ， 其中最常用的是 pBR322 ， pUC19。 (3)具有一個(gè)以上的標(biāo)志 ， 便于篩選 。 載體應(yīng)具備下列條件 ： (1) 有復(fù)制起點(diǎn)，能自我復(fù)制； (2)具有高效調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)； (3)對(duì)某一種限制酶只有一個(gè)切點(diǎn)； (4)必須有一種選擇性遺傳標(biāo)記； (5)攜帶外源基因的幅度寬； (6)分子量小，拷貝數(shù)多 . 載體的種類(lèi) 按來(lái)源分： 質(zhì)粒載體 (plasmid vector)原核 、噬菌體載體(phage vector)原核 、柯氏質(zhì)粒載體 (cosmid vector)真核 、病毒載體 (virus vector )真核 . 按作用分： 克隆載體 (cloning vector )、表達(dá)載體(expression vector)、穿梭載體 (shuttle vector) 1. 質(zhì)粒載體 : (1)分子量較小 ,在細(xì)菌中有較多的拷貝數(shù) 。l Final volume) 181。l ) 181。l 1 181。M (50pmols/50181。l ) 5 181。M (50pmols/50181。l ) 5 181。l 200 181。l in a micro Eppendorf() tube COMPONENT VOLUME Final Concentration 10PCR buffer 5 181。C What do we achieve by cycling temperature in the presence primers, dNTP, Taq polymerase? Round 1 Anneal primers Extend primers The exponentia
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