培訓課件：酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)操作注意事項-文庫吧資料
2024-08-22 15:38本頁面
【正文】 浸泡時間和孔間洗液最好不要互相流動。 ?在實驗室中， ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機洗板。 ?洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。 5 洗板 ?洗滌在 ELISA雖不是一個反應步驟，但也 決定著實驗的成敗 。讓反應板飄浮在水面上。因此反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。 ?以前在使用 96孔板的 ELISA測定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應”，即外周孔顯色較中心孔深。因此，如須選擇反應條件，建議在臨床ELISA測定中盡量使用較低溫度較長反應時間的條件。如 2－ 8℃ 下反應 24小時。 ?在有的 ELISA試劑盒的說明書中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是 37℃ 下 1小時，另一種則為 43℃ 下 45分鐘。為避免蒸發(fā)，板上應貼片或封蓋。 ?一般來說，加完樣本或反應試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內溫度從室溫升至37℃ ，需要一定的時間，尤其是在 室溫比較低 以及非水浴的狀態(tài) 下，這段升溫時間可能還比較長，而在臨床實驗中，很少有人注意這個問題，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就很容易造成在實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。一般溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，所需時間相對較短。 4 溫育 ?溫育是 ELISA測定中影響測定成敗 最為關鍵 的一個因素。滴加時，除了要注意滴加的角度垂直、一致外，滴加的速度也很重要。 ?（ 3）加酶結合物、加底物，應使加液量準確均一、加液過程迅速完成。加樣時如有氣泡，抗原抗體不能有效地結合會導致弱陽性甚至假陰性。 3 加樣本及反應試劑 ?在 ELISA實驗 中一般有 3次加樣步驟，即加樣品、加酶結合物、加底物和顯色劑。這樣做的目的，主要是為了縮短升溫時間，使反應孔內的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。 ? 終止液為硫酸。包被抗原或抗體與聚苯乙烯固相載體通過疏水基團作用物理吸附結合 ? 常用的酶： HRP， AP，葡萄糖氧化酶， βD半乳糖苷酶和脲酶等。 ?（ 2）冰凍保存的樣品須注意避免因停電等造成的反復凍融。 1 標本的收集和保存 ?（ 1）細菌生長所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產生分解作用；一些細菌的內源性酶可對以相應酶作標記的測定方法產生非特異性干擾。 二、 ELISA具體操作 ? 1 標本的收集和保存 ? 2 試劑的準備 ? 3 加樣本及反應試劑 ? 4 溫育 ? 5 洗板 ? 6 顯色 ? 7 比色 ? 8 結果判斷 1 標本的收集和保存 ?樣品必須臵冰箱中冷凍保存。 ?移液槍長時間不用時建議將刻度調至最大量程，讓彈簧恢復原形，保持松弛狀態(tài)，延長移液槍的使用壽命。 ?如有液體進入槍體，應及時擦干。 ?移液槍應輕拿輕放， 不能將已吸有液體的移液槍平放或倒臵， 以免液體倒流腐蝕活塞彈簧 。 ?（ 6） 使用完畢
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