【正文】 及轉(zhuǎn)化的基本過(guò)程。（8）翻譯后加工機(jī)制好，便于真核目的基因的高效表達(dá)。（6）選擇蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的細(xì)胞，以利于穩(wěn)定大量收集目的蛋白產(chǎn)物。（4）重組DNA分子的篩選要方便。（2）重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞要方便。（4）SSH技術(shù)中所研究的材料的差異不宜太大，最好是只有細(xì)微差別。同樣地，如果兩組tester cDNA與接頭的連接效率不同，也將丟失一些差異表達(dá)cDNA；有時(shí)會(huì)產(chǎn)生嵌合cDNA（幾率為2%）。抑制性差減雜交的缺點(diǎn)（1）SSH技術(shù)的不足之處在于，每次只能比較兩種樣品之間基因表達(dá)的差異。（3）速度快，效率高：一次SSH反應(yīng)可以同時(shí)分離幾十或成百個(gè)差異表達(dá)基因。抑制性差減雜交的優(yōu)缺點(diǎn)有哪些？抑制性差減雜交的優(yōu)點(diǎn)（1）假陽(yáng)性率低：這是它的最大優(yōu)點(diǎn)，由于SSH方法采用兩次消減雜交和兩次PCR，保證了該方法具有較高特異性。對(duì)獲得表達(dá)差異的基因片段進(jìn)行回收、克隆、鑒定及分析。（1）mRNA差異顯示技術(shù)的基本原理 DDRTPCR技術(shù)以分子生物學(xué)上最廣泛應(yīng)用的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR反應(yīng)和聚丙烯酰胺凝膠電泳為基礎(chǔ)。包括退火連接法、多步退火延伸連接法和由內(nèi)向外多步退火延伸合成法。OH上的保護(hù)劑DMT，進(jìn)行下一輪延伸反應(yīng)。OH之間形成一個(gè)亞磷酸三酯，活化核苷酸上的539。OH用二對(duì)甲氧三苯甲基（DMT）保護(hù)，堿基上的氨基用苯甲酸保護(hù)；（2）核苷酸的339。試述利用亞磷酸三酯法進(jìn)行DNA固相化學(xué)合成的步驟?；蚪M含有的基因在特定的組織細(xì)胞中只有一部分表達(dá)，而且處在不同環(huán)境條件、不同分化時(shí)期的細(xì)胞其基因表達(dá)的種類和強(qiáng)度也不盡相同，所以cDNA文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性。cDNA文庫(kù)是以mRNA為模板，在體外經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化反轉(zhuǎn)錄成cDNA后與適當(dāng)載體連接，再轉(zhuǎn)化受體菌。基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的差異有哪些？基因組文庫(kù)是用限制性內(nèi)切酶對(duì)細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA進(jìn)行切割，得到大量基因組DNA片段，然后將這些DNA片段與載體連接，再轉(zhuǎn)化到受體菌中。什么是cDNA文庫(kù)？它的基本構(gòu)建流程是怎樣的？以mRNA為模板，在體外經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)化受體菌并繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。 （5）盒式PCR，盒式PCR可特異性地?cái)U(kuò)增cDNA或基因組DNA上的未知區(qū)域。（3）錨定PCR，是一種根據(jù)已知目的基因的一小段序列信息來(lái)快速擴(kuò)增已知序列上游或下游片段的技術(shù)。（8）連接的溫度用于擴(kuò)增基因的PCR方法有哪些？各有什么特點(diǎn)？（1）RTPCR法，是一種從細(xì)胞mRNA中高效擴(kuò)增cDNA序列的方法，它將反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合。（6）插入DNA片段與載體的比例。（4）選用的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA的切割頻率及酶切反應(yīng)條件。（2）高分子量的染色體DNA的獲得 。構(gòu)建流程一般來(lái)說(shuō)，構(gòu)建基因組文庫(kù)的基本步驟有五步：①高分子量DNA的制備；②外源DNA片段與載體分子的重組；③重組載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞；④陽(yáng)性克隆的挑選；⑤基因組文庫(kù)的評(píng)價(jià)和鑒定。目前幾種常見(jiàn)的基因克隆手段，如基因組DNA文庫(kù)、cDNA 文庫(kù)、PCR擴(kuò)增法、人工化學(xué)合成法、差異克隆技術(shù)等。雙元載體不僅構(gòu)建方便，而且其TDNA整合進(jìn)入植物細(xì)胞不需要帶進(jìn)許多冗余DNA序列，轉(zhuǎn)化效率高于一元載體。雙元表達(dá)載體由2個(gè)分別含有TDNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質(zhì)粒構(gòu)成，即微型Ti質(zhì)粒（minTi plasmid）和輔助Ti質(zhì)粒（helper Ti plasmid）。（3）核糖體結(jié)合位點(diǎn)：核糖體（rRNA）是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，mRNA有效地翻譯依賴于mRNA的穩(wěn)定性及其與核糖體結(jié)合的能力。（2）終止子：在一個(gè)基因的3′端或是一個(gè)操縱子的3′端往往還有一特定的核苷酸序列，它有終止轉(zhuǎn)錄的功能，這一DNA序列稱為轉(zhuǎn)錄終止子（terminator）。（1）啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游，是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列，是啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄所必需的一段DNA順式調(diào)控元件。目的基因通過(guò)這些酶切位點(diǎn)組裝后，其轉(zhuǎn)化子的表達(dá)方法為先在30℃下增菌，～ OD時(shí)，升溫至42℃進(jìn)行誘導(dǎo)5 hr即可高表達(dá)目的蛋白。當(dāng)進(jìn)行基因表達(dá)時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物為谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶和目的基因產(chǎn)物的融合體。③融合型蛋白表達(dá)載體pGEX系統(tǒng)：pGEX系統(tǒng)由Pharmacia公司構(gòu)建，由3種載體pGEXlXT，pGEX2T和pGEX3X以及一種用于純化表達(dá)蛋白的親和層析介質(zhì)Glutathione Sepharose 4B組成。②分泌型克隆表達(dá)載體pinⅢ系統(tǒng)：這個(gè)載體系統(tǒng)是以pBR322為基礎(chǔ)構(gòu)建的。①非融合型表達(dá)載體：它具有一個(gè)強(qiáng)的tac（trplac）啟動(dòng)子。（4） 建立重組的λDNA分子的體外包裝系統(tǒng)，高效的感染受體細(xì)胞。（2） 去除多余的限制酶切割位點(diǎn)，確定1～2個(gè)單酶切位點(diǎn)作為克隆位點(diǎn)。這種載體適用于可編碼b—半乳糖苷酶C段部分序列（ω片段）的宿主細(xì)胞。pUC質(zhì)粒載體具有來(lái)自大腸桿菌lac操縱子b半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子和N端前146個(gè)氨基酸的編碼序列（α片段），這部分基因序列又特稱為lacZ162。pUC系列的質(zhì)粒載體通常是成對(duì)構(gòu)建的，二者的差別僅在于多克隆位點(diǎn)的方向相反。（4） 具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。（2） 帶有盡可能多的單一限制性酶切位點(diǎn)，以供外源DNA片段定點(diǎn)插入。在質(zhì)粒載體與外源DNA連接構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，使用堿性磷酸酶處理酶切過(guò)的質(zhì)粒，可以降低載體DNA的自連。為什么通過(guò)堿性磷酸酶處理可以防止質(zhì)粒載體DNA自連的作用？答：堿性磷酸酶可催化除去DNA、RNA的5′磷酸基團(tuán)。（３）檢測(cè)：向酶切反應(yīng)液中加入電泳上樣緩沖液后，可進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。（２）酶切：將反應(yīng)體系中的各組分按比例加好后，用槍頭混勻，使用離心機(jī)快速離心一下，將反應(yīng)液離到管底，在推薦的溫度下進(jìn)行酶切反應(yīng)（一般是37℃,也有28℃等其他溫度，需要參照商品說(shuō)明）。為了保證反應(yīng)的可控性，酶一般是在最后一步加入。答：一般的步驟是：（１）加樣：取一只滅菌的Eppendorf離心管，按以下劑量依次加入相應(yīng)成分：基因組DNA酶切體系為(總體積50μＬ)DNA 500ng10Buffer 5μLEnzyme 15U/μg DNAddH2O up to 50μL對(duì)于用作回收的大量DNA進(jìn)行酶切，一般采用總體積為50μL體系，而進(jìn)行檢測(cè)的酶切反應(yīng)，則切割反應(yīng)體系總體積在10μL或20μL就可以，反應(yīng)體系中各成分的比例要基本保持穩(wěn)定，可適當(dāng)調(diào)節(jié)DNA的量和反應(yīng)時(shí)間等，達(dá)到好的酶切效果。（3）采用SI核酸酶消化法，除去單鏈區(qū)的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，就可將獲得完整的DNA分子。胸腺嘧啶可以與腺嘌呤配對(duì)互補(bǔ)，所以采用oligo（dT）做引物，與mRNA3′端的poly（A）尾巴結(jié)合。答：酶3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性聚合速率持續(xù)合成能力 DNA聚合酶I低存在中等低Klenow酶低無(wú)中等低T4 DNA 聚合酶高無(wú)中等低天然T7 DNA聚合酶高無(wú)快高化學(xué)修飾T7 DNA聚合酶低無(wú)快高遺傳修飾T7 DNA聚合酶(Δ28)無(wú)無(wú)快高Taq DNA聚合酶無(wú)存在快高逆轉(zhuǎn)錄酶無(wú)無(wú)慢中等利用逆轉(zhuǎn)錄酶和mRNA模板合成cDNA的主要步驟是什么？答：（１）以具有poly（A）結(jié)構(gòu)的mRNA做模板，并以12—18個(gè)堿基長(zhǎng)的多聚胸腺嘧啶寡核苷酸oligo（dT）片段作引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的5′3′聚合酶活性催化下，合成出與模版mRNA的單鏈互補(bǔ)的cDNA單鏈。（3）切割后形成各種粘性末端或平整末端。這些序列是核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別序列，同時(shí)也是這些酶的切割位點(diǎn)或稱為靶序列。Ⅱ型限制性內(nèi)切酶有哪三個(gè)主要的作用特性？答：（1）識(shí)別并切割特異核苷酸序列。人們使用限制性內(nèi)切酶寄主菌的種屬名稱，來(lái)命名限制性內(nèi)切酶，即以微生物屬名第1字母（大寫(xiě)）和種名前兩字母（小寫(xiě)）寫(xiě)成斜體三字母，例如，大腸桿菌（Escherichia coli）用Eco表示。由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶(簡(jiǎn)稱限制酶)。第四章什么是DNA限制性內(nèi)切酶；基因工程中常用的是哪種類型，如何命名？答：DNA限制性內(nèi)切酶：是能識(shí)別并切割雙鏈DNA序列內(nèi)部特定核苷酸序列的DNA水解酶。④固化探針雜交：原理是使未標(biāo)記固化探針通過(guò)雜交與靶RNA或DNA結(jié)合，漂洗后，用酶標(biāo)抗DNA：RNA抗體或抗DNA：DNA抗體與雜交物結(jié)合，將乳膠顆粒收集，吸附到膜上后漂洗、加入底物顯色并進(jìn)行測(cè)定，探針濃度為2μg/ml,80℃雜交，可在1015min完成，檢測(cè)的敏感性為5106靶序列。②組織原位雜交：它與菌落原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交，而組織原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，由此可以確定探針互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。漂洗除去未雜交的探針，與X光底片一起曝光。？ 核酸雜交還包括：菌落原位雜交、組織原位雜交、固相夾心雜交、液相核酸分子雜交、固化探針雜交、反向雜交等。，核酸印跡轉(zhuǎn)膜有哪些方法?核酸雜交的基本過(guò)程：將核酸從細(xì)胞中分離純化后，在體外與探針雜交，或直接在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行雜交的過(guò)程。核酸探針制備方法有：基因組DNA探針、 cDNA探針、RNA探針、 寡核苷酸探針等。多重PCR技術(shù)：即在同一試管中加入多對(duì)引物，擴(kuò)增同一模板的幾個(gè)區(qū)域。這種方法除了使用的兩種引物濃度相差100倍之外，其它方面與標(biāo)準(zhǔn)的PCR并沒(méi)有本質(zhì)的區(qū)別。：反向PCR，不對(duì)稱PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR，多重PCR反向PCR: 用于擴(kuò)增位于靶DNA區(qū)段之外的兩側(cè)的未知DNA序列。⑥其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。此時(shí)，可采用使反應(yīng)溫度緩慢升高到70~75℃的方法。④PCR反應(yīng)的延伸溫度建議選擇的70~75℃之間，此時(shí)，Taq DNA聚合酶具有最高活性。③復(fù)性溫度的選擇，可以根據(jù)引物的長(zhǎng)度及其G＋C含量確定。過(guò)高溫度或高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)對(duì)Taq DNA聚合酶活性和dNTP分子造成損害。體系反應(yīng)條件按優(yōu)化：①首先是使模板DNA解離成為單鏈，這個(gè)過(guò)程可以通過(guò)加熱完成，在90~95℃條件下，根據(jù)模板DNA復(fù)雜程度，調(diào)整變性溫度和時(shí)間。④引物的5’末端可以不與目的片段互補(bǔ)，可以包含內(nèi)切酶位點(diǎn)或啟動(dòng)子序列，但在下一輪反應(yīng)中，這些序列會(huì)被同樣合成。②在設(shè)計(jì)時(shí)必須特別注意引物之間不能互配形成雙鏈結(jié)構(gòu)，引物內(nèi)部也不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。根據(jù)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短及其復(fù)雜程度（G＋C含量）不同而有所區(qū)別。Taq酶的不足之處：使用Taq DNA聚合酶濃度過(guò)高，會(huì)引起非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增；濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。理論上20~25次循環(huán)之后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能都達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。影響因素有：PCR反應(yīng)模板的種類、數(shù)量及純度；PCR反應(yīng)的緩沖液；底物（脫氧核糖核苷三磷酸，dNTPs）濃度；PCR反應(yīng)的DNA聚合酶；PCR反應(yīng)的引物，PCR反應(yīng)條件的選擇。應(yīng)用價(jià)值：PCR技術(shù)不僅可以用來(lái)擴(kuò)增與分離目的基因，而且在臨床醫(yī)療診斷、胎兒性別鑒定、癌癥治療的監(jiān)控、基因突變與檢測(cè)、分子進(jìn)化研究，以及法醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域都有著重要的應(yīng)用。此外，DNA聚合酶同樣需要有一小段單鏈DNA來(lái)啟動(dòng)（“引導(dǎo)”）新鏈的合成?；厥盏腄NA片段的方法有：電泳洗脫法、DEAE纖維素膜插片法、低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳挖塊法、凍融法、玻璃奶法、QIAEX法等。適用范圍：片段小于1000bp用聚丙烯酰胺凝膠，含高濃度（7mol/L)尿素的變性聚丙烯酰胺凝膠用于分離短的（500b)的單鏈DNA或RNA，特別是實(shí)驗(yàn)室手工小片段測(cè)序。適用范圍：不同濃度的瓊脂糖凝膠電泳可分辯不同大小范圍的DNA片段，對(duì)于雙鏈DNA來(lái)說(shuō)，DNA片段在500~60000bp用瓊脂糖凝膠分離。瓊脂糖凝膠作為電泳基質(zhì)有如下優(yōu)點(diǎn)：①形成的凝膠具有大量微孔，其孔徑尺寸取決于它的濃度，%瓊脂糖的孔徑為800nm，1%瓊脂糖孔徑為150nm；②透明，無(wú)紫外吸收；③無(wú)毒，熱熔冷凝，制膠方便；④熱可逆性，具有一定強(qiáng)度。但不同大小的核酸分子長(zhǎng)鏈均勻分布有磷酸基團(tuán)，荷質(zhì)比趨于一致。4. 不同大小分子核酸電泳分離的原理是什么？瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳有什么特點(diǎn)？各自的適應(yīng)范圍？核酸電泳有哪些檢測(cè)方法？原理：但其中最關(guān)鍵的是抑制RNA酶的活性。④羥基磷灰石柱層析法：利用核酸的帶電性，可用于純化。溴乙錠（EB）