【正文】 行觀察異硫氰酸熒光黃（ FITC）為黃綠色熒光；四乙基羅達明（ BR200)為明亮橙色熒光；四甲基異硫氰基羅丹明（ TRITC)為橙紅色熒光； CY3為鮮紅色熒光。 %伊文氏蘭襯染 3min。 370C環(huán)境下孵育 50min。是熒光亮度增強，靈敏性高，目前應用廣泛。 間接法： 是直接法的重要改進。直接用于組織抗原的檢查。以熒光抗體方法較為常見。 第二節(jié) 免疫熒光細胞化學技術 免疫熒光細胞化學技術 (immunofluorescence cytochemistry technique） 是將已知的抗原或抗體標記上熒光素，再與組織切片或涂片中相應的抗原或抗體起反應，從而使形成的免疫復合物上帶有一定量的熒光素，在熒光顯微鏡下借助紫外光激發(fā)呈現(xiàn)出黃綠色或橘紅色熒光，由此檢測抗原或抗體并定位。一般程序是： ① 標記抗體與標本中抗原反應結(jié)合； ② 用 PBS洗去未結(jié)合的成分； ③ 直接觀察結(jié)果 (免疫熒光直接法 )；或 顯色后再用顯微鏡觀察 (免疫酶直接法 )。我國自制抗體種類較少。 不同的免疫細胞化學技術，各具有獨特的試劑和方法，但其基本技術方法是相似的，都包括 : 抗體的制備，組織材料的處理，免疫染色、對照試驗、顯微鏡觀察等步驟。沒有抗原的刺激，機體不能產(chǎn)生抗體；利用抗體可以檢測抗原物質(zhì)。 抗體的種類： 根據(jù)獲得抗體的途徑或來源不同分類 免疫抗體，天然抗體，自身抗體，完全抗體，不完全抗體。含有免疫球蛋白的血清稱免疫血清。也可有外源性和內(nèi)源性之分。物質(zhì)所具有的這種特性稱為抗原性。 3. 方法步驟統(tǒng)一 雖然免疫組化技術的方法很多，但基本程序相同只要掌握了原理和一種方法，其它方法大同小異。 乳腺導管癌ER 細支氣管肺泡癌TTF1 免疫細胞化學的突出優(yōu)點是： 抗原抗體反應是特異性最強的反應之一，細胞化學所用的抗體必須是特異性強的多價或單價抗體，具有高度的認別能力，在抗原識別上可達到單個氨基酸的水平，這是其它組織化學方法難以相比的。 免疫組織化學主要 原理 是用熒光素、生物素或地高辛等標記的抗體（或抗原）對細胞或組織內(nèi)的相應抗原（或抗體）進行定性、定位或定量檢測，經(jīng)過組織化學的呈色反應之后，用顯微鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡觀察。 腦尼氏體 星形細胞 腎淀粉樣變 剛果紅染色 肝表面抗原維多利亞藍 第三章 免疫組織（細胞）化學 (immunohistochemistry,IHC) 第一節(jié) 免疫組織化學概論 免疫組織化學是利用免疫學抗體與抗原結(jié)合的原理及組織化學技術對組織、細胞特定抗原或抗體進行定位和定量的技術，是免疫學與細胞化學相結(jié)合的一個分支學科。 應用： 判定多種組織、器官的病變程度及修復情況；區(qū)分腫瘤組織中的纖維與平滑肌成分。 特殊染色的方法很多，在此僅介紹膠原纖維染色。 結(jié)締組織含有三種纖維 ， 即膠原纖維 、 網(wǎng)狀纖維和彈力纖維 。故稱特殊染色。此過程稱藍化作用。 : 當分化以后蘇木精在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài)，在堿性條件下則處于蘭色離子狀態(tài)。將此過程稱為染色的分化作用。 : 水洗是為了使蘇木精進入細胞核內(nèi)，使細胞核著色；染色后的水洗是為洗去未與切片結(jié)合的染液；分化后的水洗是為了除去分化液和脫下的染料。 伊紅染色后的梯度酒精 (80%,90%,95%,100%)是為了逐漸脫去組織中的水分 ,為二甲苯進入細胞 (透明 )創(chuàng)造條件。酒精和二甲苯互溶，二甲苯被除去。以利于光線的透過。 12. 中性樹膠封固。 10. 80%、 95%、純酒精 2(脫水 )各 5分鐘。 8. 充分水洗藍化 30分鐘。 。 （水化）。 2中各 5分鐘以洗去二甲苯。 伊紅 Y: 是一種化學合成的酸性染料，在水中解離成帶負電的陰離子，與蛋白質(zhì)的帶氨基正電荷（陽離子）結(jié)合而使細胞漿染成紅色。 細胞質(zhì)的染色原理 :細胞之內(nèi)主要成分是蛋白質(zhì) ,為兩性化合物，細胞漿的染色與 pH值有密切關系，當 pH調(diào)到蛋白質(zhì)等電點時，胞漿對外不顯電性，此時酸或堿性染料不易染色。 蘇木素 (haematoxylin)— 伊紅染色法，簡稱HE染色，是醫(yī)學領域中最廣泛應用于細胞和組織的染色方法，也被稱為常規(guī)染色。 第二節(jié) 蘇木素 — 伊紅染色（ HE染色） 蘇木素（ haematoxylin） 又稱蘇木精，一種天然堿性染料，對細胞核具有優(yōu)良的染色能力。組織染色屬于生物染色的范疇。 ：烘烤箱的溫度為 630C以下，時間常為 12小時。 ：要求質(zhì)量，左手毛筆，右手眼科鑷，轉(zhuǎn)速均勻。 ：切片機的進度尺常定在 4－ 6μm ，切片刀的傾斜角在 20度左右。 ? 方法：透明后的組織 520C－ 540C（軟蠟）1小時 540C－ 560C石蠟 1小時 580C－ 600C（硬蠟） 1小時 540C－ 560C石蠟進行包埋 第三節(jié) 組織切片 切片（ section） ：組織四周應留有 2－ 4 mm 蠟邊，蠟塊的上下兩邊應平行。其中最常用的是石蠟。 五、浸蠟與包埋 浸蠟 (paraffin infiltrating)和包埋 (embedding) 是指標本經(jīng)過前期處理后，再置于支持物中，使支持物透入組織內(nèi)部，并將組織埋入、包裹的過程。它比二甲苯透明力差，但不宜使組織變脆，使大塊組織的良好透明劑 常用的透明方法 ? 二甲苯透明法（常用）：徹底脫水的組織塊 二甲苯 1 二甲苯 2，此二步總的時間不超過 40分鐘。 常用的透明劑 ? 二甲苯：為最常用的透明劑，有毒、易燃、易揮發(fā)；沸點 1380C1400C,長期接觸對粘膜有刺激作用。透明劑即能與脫水劑相混溶，又能與包埋劑（石蠟 ）相混溶，起到橋梁作用。因此透明是石蠟包埋前的一個特定步驟。 常用的脫水劑和脫水方法 脫水劑有：乙醇、丙酮等 80％ 酒精 30 分鐘 95％ 酒精 1－ 2小時 95％ 酒精 1－ 2小時 100％酒精 1－ 2小時 100％酒精 1－ 2小時 四