【正文】 胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。 化學(xué)破碎法 酶溶法、酸 堿法、有機(jī)溶劑胞溶法、表面活性劑法 酶溶法：利用酶分解細(xì)胞壁上特出的化學(xué)鍵，使細(xì)胞壁破碎。 機(jī)理：在超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用 (cavitation)，空穴的形成和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。 ? 超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發(fā)生器和換能器組成 ，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動(dòng)。 C、珠磨機(jī)可用于酵母和細(xì)菌，但對(duì)真菌菌絲和藻類更合適 . 3) 撞擊破碎法 優(yōu)點(diǎn)： A、細(xì)胞破碎僅發(fā)生在撞擊的一瞬間，破碎程度均勻，避免反復(fù)和過度破碎； B、破碎的程度可無級(jí)調(diào)節(jié)，避免細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，特別適合于細(xì)胞器的回收； C、實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模均可應(yīng)用。 細(xì)胞濃度： 優(yōu)點(diǎn)： A、在大規(guī)模 cell 破碎中 ，高壓勻漿機(jī)和珠磨機(jī)用得最多 。 細(xì)胞抗破碎系數(shù) a： a 酵母 =， a 大腸桿菌 = 。 破碎次數(shù) N： N?， R ?。相反 , R? 。 Q?, E?， R?； Q?， E?， R?。一般產(chǎn)熱量隨細(xì)胞濃度的降低而下降，但單位細(xì)胞重量的能耗 ? 。如產(chǎn)物熱不穩(wěn)定，必須控溫。 細(xì)胞破碎和產(chǎn)物釋放原理 物理法 化學(xué)法 固體剪切法 (珠磨法 ) 酶溶法 液體剪切法 化學(xué)降解法（酸堿法） 撞擊法 表面活性劑法 超聲法 有機(jī)溶劑膨脹法 滲透法 萃取法 細(xì)胞破碎理論 1)、細(xì)胞破碎 A 壓撞 B 剪切 Ca 滲透 Cb 凍脹 D 破壁破膜 2)、產(chǎn)物釋放 細(xì)胞破碎技術(shù) 機(jī)械破碎 ： 主要有高壓勻漿、珠磨、撞擊破碎和超聲波破碎等方法 1)、固體剪切法 (珠磨法 , c 最有效的物理破碎法 ) 影響因素： a) 轉(zhuǎn)盤外緣速度 b) 珠粒添量和大小 c) 溫度：溫度在 540?C 范圍內(nèi)對(duì)破碎影響較小。 酵母菌： 葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)，主要阻力來自于壁結(jié)構(gòu)交換的緊密程度和厚度。另外一些小的、難過濾的固體顆粒可用離心分離。 缺點(diǎn)：Ａ、占地大，有效過濾面積低，Ｂ、設(shè)備投資高，能耗高。 壓力系列： 帶式 、板框、加壓、氣壓罐式壓濾機(jī) 應(yīng)用：用于很難處理的、高黏度、高細(xì)顆粒含量的發(fā)酵液的固液分離。 優(yōu)點(diǎn)：Ａ )、發(fā)酵液處理量大，濾餅厚達(dá) 200mm， Ｂ )、濾餅洗滌容易，效果好，無須攪拌， Ｃ )、自動(dòng)化、操作簡(jiǎn)單，清洗保養(yǎng)容易。 缺點(diǎn)：Ａ、壓力低，僅應(yīng)用于低黏度發(fā)酵液， B、設(shè)備投資高。 圓盤真空過濾器 應(yīng)用：同上。 常用新型過濾器： 轉(zhuǎn)鼓真空過濾器 應(yīng)用：大規(guī)模生物分離的主要過濾設(shè)備，用于較難分離的低黏度發(fā)酵液 優(yōu)點(diǎn)：Ａ、大規(guī)模，Ｂ、自動(dòng)化、操作簡(jiǎn)單，Ｃ、濾布裝卸容易、易保養(yǎng)維護(hù)。 意義：過濾的流量方程 恒壓過濾方程 (最常用模式 ) 恒壓條件下對(duì) Ruth’s 方程積分： t0：為透過虛擬體積所要的虛擬時(shí)間。過濾的阻力來自過濾介質(zhì)和濾餅。 ? = 濕濾餅的質(zhì)量：干濾餅的質(zhì)量。 意義： A、反映過濾的難易程度，越大，越困難； B、與顆粒大小、孔隙率等的關(guān)系。 方程適應(yīng)條件： A、薄層區(qū)域表面的流速， B、非常高的孔隙率， C、非常廣的顆粒尺寸的分布， D、纖維狀的、可壓縮的和吸濕性的填充物。 Darcy 定理 U = 流體的速度 (in: m/s)， ?p = 壓力差 (in: Pa)， l = 床層厚度 (in: m)， K = Darcy’s 滲透系數(shù)，與流體和床層的性質(zhì)有關(guān) 。助濾劑使用方法主要有兩種：混合、預(yù)涂。 （ 2）過濾分類： 深層過濾、濾餅過濾 （ 3）過濾推動(dòng)力：重力（漏斗過濾）、壓力（加壓過濾）或真空（抽濾）、離心力（離心過濾）。 （ 1）過濾介質(zhì)（ Filter medium）： 過濾介質(zhì)應(yīng)具有以下特性：多孔性，足夠的機(jī)械強(qiáng)度，盡可能小的流動(dòng)阻力，耐腐蝕性，耐熱性，易于再生。 濾餅形成時(shí)間方程： 意義： 得到濾餅厚度 (R0RC)所需時(shí)間，用于工藝放大 Q 超速離心機(jī)： 分離因子在 100,000g 以上的離心設(shè)備 應(yīng)用： A. 測(cè)定分子量 : B. 大分子的純度鑒定 C. 大分子的構(gòu)相變化 D. DNA 半保留復(fù)制 過濾（ Filtration） 概念： 過濾是在外力作用 下 ，利用過濾介質(zhì)使懸浮液中的液體通過，而固體顆粒被截留在介質(zhì)上，從而實(shí)現(xiàn)固液分離的一種單元操作。 對(duì)于沉降，重力沉降加速度為重力加速度）ν g= d2(ρ sρ )g/(18μ ) () 離心沉降加速度則不同 a=rω 2 ν s= d2(ρ sρ )rω 2/(18μ ) () ω 轉(zhuǎn)鼓回轉(zhuǎn)角速度， r/s） r 為轉(zhuǎn)鼓中心軸線與微粒間距離， m 代入得 （ ） ν s= d2(ρ sρ )rω 2/(18μ ) () 還可以用 表達(dá) 其中 S 稱為沉降系數(shù)，是溶劑物性的常數(shù) 沉降系數(shù) S 計(jì)算： 顆粒在 20?C 水中的 Sw,20 為 v 為溶質(zhì) (顆粒 )的單位質(zhì)量的體積 , ? w,20 和 ? L,T 分別為 20 ?C 的水和 T ?C 溶劑的黏度， ?w,20 和 ?L,T 分別為 20 ?C 的水和 T ?C 溶劑的密度。 顆粒離心沉降的速度方向是由圓心沿徑向指向外周，但由于顆粒和流體同時(shí)做圓周運(yùn)動(dòng)，顆粒的實(shí)際運(yùn)動(dòng)軌跡是一個(gè)半徑逐漸擴(kuò)大的螺旋線。 在實(shí)際情況中還需考慮以下因素的影響：① 干擾沉降；② 端效應(yīng)；③ 分子運(yùn)動(dòng)；④ 非球形；⑤ 液滴或氣泡的運(yùn)動(dòng) 。 通過實(shí)驗(yàn)得到曳力系數(shù)與雷諾數(shù)的關(guān)系繪成算圖 ,將他們回歸成關(guān)聯(lián)式為： ①層流區(qū)（ Stokes 區(qū)， Re0 2 或 ） maFFFF ???? ???? bdg 阻力浮力）（重力04266 2203s3 ?????? madugdgdF ???????04266 2203s3 ?????? madugdgdF ???????? ??? ??34 s0 gdu ??)(Re0f?? ??00Re du? ②過渡區(qū)（ Allen 區(qū)， 2 Re0 500） ③湍流區(qū)（牛頓區(qū)， 500 Re0 202000 ） ④ Re0 202000 后， ζ 驟然下降，在 Re0 =(3~10) 105 范圍內(nèi)可近似取 ζ = 。 根據(jù)沉降作用力可分為：重力沉降、離心沉降 根據(jù)沉降粒子間相互影響程度可分為：自由沉降和干擾沉降 重力沉降（ Gravitational sedimentation） （ 1）球形顆粒的自由沉降速度 以重力的方向?yàn)檎较? 什么情況下顆粒在流體中會(huì)發(fā)生沉 降過程？ 直徑為 d、顆粒密度為 ρ s 的球形顆粒在密度為流體中的重力和浮力分別為： 顆粒做勻速運(yùn)動(dòng)，沉降速度恒定不變，該速度稱為 自由沉降速度 。但是，對(duì)大多數(shù) 生物發(fā)酵液可以離心但不能有效地過濾分離，所以離心往往是很有效的方法。通常情況下離心只能得到一種較為濃縮的懸浮液或漿體。由于沉降和離心相似，這兒就放在一塊討論。但當(dāng)固體顆粒細(xì)小而難以過濾時(shí)，離心操作往顯得十分有效。當(dāng)發(fā)酵液不易被過濾純化時(shí)，我們可以采用離心的方法來分離。粒徑的變化可以從直徑約為 1um的微生物，到直徑為 1mm 的不溶性物質(zhì)。這些不溶性固體的濃度和顆粒大小的變化范圍很寬。 色素物質(zhì)的去除，一般以使用離子交換樹脂、離子交換纖維、活性炭等材料的 吸附法來脫色 最為普遍。 3．多糖的去除 酶解法可將混合液中的不溶性多糖物質(zhì)酶解，使其轉(zhuǎn)化為溶解度較大的單糖，從而改變流體的流動(dòng)特性，提高過濾速率。常用的有等電點(diǎn)沉淀法、變性沉淀法、鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、反應(yīng)沉淀法等。生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，并且能使膠狀物和懸浮物凝固，從而改善過濾性能。 5．加入反應(yīng)劑 有時(shí)加入某些不影響目的產(chǎn)物的反應(yīng)劑，可消除發(fā)酵液中某些雜質(zhì)對(duì)過濾的影響，從而提高過濾速率。 助濾劑種類 ：硅藻土、膨脹珍珠巖、石棉、纖維素、未活化的炭、爐渣、重質(zhì)碳酸鈣，及它們的混合物等。 惰性助濾劑： 一種顆粒均勻、質(zhì)地堅(jiān)硬的粒狀物質(zhì)，用于擴(kuò)大過濾表面的適應(yīng)范圍，減輕細(xì)小顆粒的快速擠壓變形和過濾介質(zhì)的堵塞。 機(jī)理 ：絮凝劑主要起中和電荷、橋架和網(wǎng)絡(luò)作用 凝聚和絮凝技術(shù)能有效的改變細(xì)胞菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的 分散狀態(tài) ,使其聚集起來 ,增大體積以便固液分離 ,常用于菌體細(xì)小而且黏度大的發(fā)酵液的預(yù)處理中 . 惰性助濾劑 5．加入反應(yīng)劑 發(fā)酵液的帶電現(xiàn)象 發(fā)酵液中的細(xì)胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子的表面，一般都帶有電荷，帶電的原因很多，主要是 吸附溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離。大分子聚電解質(zhì)將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成絮凝團(tuán)的過程。 4).絮凝：指使用絮凝劑（天然的和合成的大分子量聚電解質(zhì)）將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成 10mm 大小絮凝團(tuán)的過程。膠體粒子 (10100nm)中性鹽促進(jìn)下脫穩(wěn)相互聚集成大粒子（ 1mm） 機(jī)理： a 中和粒子表面電荷 b 消除雙電層結(jié)構(gòu) 凝聚劑種類： A、無機(jī)鹽類：如硫酸鋁、明礬、硫酸鐵、硫酸亞鐵、 FeCl AlCl ZnCl硫酸鎂等； B、無機(jī)堿：如 Al(OH) Fe(OH) Ca(OH) CaO 等； C、聚合無機(jī)鹽，如聚合鋁、聚合鐵。 凝聚和絮凝 1).通過電解質(zhì)的加入促進(jìn)原始溶液的 凝聚和絮凝 2).主要作用為增大混合液中懸浮粒子的 體積 ，提高固液分離速度，同時(shí)可除去一些雜質(zhì)。另外，在膜分離中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，常通過調(diào)整 pH，改變易吸附分子的電荷性質(zhì)， 以減少吸附造成的堵塞和污染 。 加熱可產(chǎn)生： ?黏度、促凝聚、 ?固體成分體積、破壞凝膠結(jié)構(gòu)、增加空隙率、去蛋白 調(diào) pH 值：方法簡(jiǎn)單有效、成本低廉 pH 直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié) pH 可改善其過濾特性。加熱不僅可以增加料液的操作特性，也可以對(duì)其進(jìn)行滅菌。 一般，由于料液通常都是高的非牛頓粘度流體或者是高度可壓縮濾餅，發(fā)酵液和其它生物溶液是極其難以過濾的，因此，必須對(duì)這些生物分離程序進(jìn)行修改。如觸變性流體，震凝性流體。一些生物材料，如細(xì)胞液，蛋清等也同屬此類。 備注： 在高分子液體范疇內(nèi)，可以粗略地把非牛頓型流體分為： 純粘性流體，但流動(dòng)中粘度會(huì)發(fā)生變化，如某些涂料、油漆、食品等。 三、培養(yǎng)液的組成： 水 7080% + 固體細(xì)胞及碎片 2030%(對(duì)微生物發(fā)酵 )+ 少量的代謝成物 + 細(xì)胞破裂后的內(nèi)容物 + 殘存的培養(yǎng)基成分 四、 培養(yǎng)液的基本特征 A、細(xì)胞成分及碎片大小不一，顆粒大小 ?，分離成本 ?。難 2)、完善老技術(shù) ：正確對(duì)待 ―新 ‖、 ―老 ‖分離技術(shù) 3)、發(fā)明新技術(shù) 研發(fā)新型高效 經(jīng)濟(jì) 的分離技術(shù) 推進(jìn)各分離技術(shù)的雜交 分離技術(shù)與發(fā)酵技術(shù)結(jié)合 強(qiáng)化化學(xué)對(duì)分離技術(shù)的影響 1. 4)、高效分離技術(shù)的工程化 5)、分離技術(shù)的環(huán)?；? 生物分離工程的發(fā)展動(dòng)向： ? （ 1） 操作集成化（擴(kuò)張床，兩水相） ? （ 2） 方法集成化（親和與膜結(jié)合） ? （ 3） 大分子與小分子相互滲透（兩水相 大分子向小分子分配） ? （ 4） 親和技術(shù)推廣與配基合成（分子印跡） ? （ 5） 優(yōu)質(zhì)層析 介質(zhì)開發(fā)（大孔親水介質(zhì)，貫注層析介質(zhì)） ? （ 6） 下游技術(shù)與上游技術(shù)相結(jié)合 (藕合分離） ? （ 7） 改進(jìn)上游因素（改進(jìn)菌種，培養(yǎng)基與發(fā)酵條件） ? （ 8） 改善環(huán)境相容性 Chapter 1 思考題 1. 生物分離工程在生物技術(shù)中的地位？ ？ ，分別包括哪些單元操作？ ，必須考慮哪些問題方能確保我們所設(shè)計(jì)的工藝過程最為經(jīng)濟(jì)、可靠？ 第二章 細(xì)胞分離與破碎 6 一、固液分離的類型： 過濾 (重力過濾器、壓濾器、真空 過濾器 ) 離心 重力沉降 二、懸浮液：指固體顆粒在 ?m 以上的固液分散體系。 2) 分離因子 (separative factor)，或分離系數(shù) (separative coefficient) 意義： A、目標(biāo)產(chǎn)物濃度 ?，雜質(zhì)濃度 ?，則分離因子大，分離效率 ?； B、 ? = 1 時(shí)，則未分離。典型的差速分離法：超濾、反滲析、電滲析、電泳和磁泳。 差速分離： 定義：利用外力驅(qū)動(dòng) 溶質(zhì)遷移 產(chǎn)生的速度差進(jìn)行分離的方法。溶質(zhì)達(dá)到相間平衡的過程為擴(kuò)散傳質(zhì)過程，平衡分離又稱擴(kuò)散分離。 平衡分離： 定義：根據(jù)溶質(zhì)在兩相間分配 平衡的差異 實(shí)現(xiàn)分離。 性