【正文】 已知的MgtE家族成員顯示了部分相似性，多序列比對表明，它們在第2和第5個跨膜區(qū)和其它成員有較高的相似性。圖5 MM281, MM281pTrc, MM281VPMgtE 在含不同鋁離子濃度的LB平板上的互補(bǔ)結(jié)果。我們從副溶血弧菌中克隆了一具 Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力的MgtE基因家族成員：VPMgtE。該菌存在于近海的海水，海底沉積物和魚類，貝殼等海產(chǎn)品中間。在這兩個跨膜區(qū)的每個突變對其轉(zhuǎn)運(yùn)能力都有影響，這也說明了這兩個跨膜區(qū)在Mg2+裝運(yùn)中的重要性。M情況下和目的蛋白相比這兩個突變株的轉(zhuǎn)運(yùn)能力竟然提高了。3．5．定點(diǎn)突變改變了VPMgtE的Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力。同時，為了證實(shí)確實(shí)是Al3+而不是Cl在起毒害作用，我們也做了KCl的實(shí)驗(yàn),與對照相比，我們沒有發(fā)現(xiàn)區(qū)別（數(shù)據(jù)未列出）。我們在pH=5時研究了VPMgtE的鋁抗性，我們發(fā)現(xiàn)VPMgtE的表達(dá)可提高M(jìn)M281對鋁毒害的抗性。MM281（實(shí)心圓），pTrc（空心圓），VPMgtE（實(shí)心三角）3. 4. VPMgtE的表達(dá)提高了MM281對鋁毒害的抗性。 的Nminimal培養(yǎng)基中的生長結(jié)果。MM281（實(shí)心圓），pTrc（空心圓），VPMgtE（實(shí)心三角）圖3B MM281,MM281pTrc,MM281VPMgtE 在100 181。圖3A MM281, MM281pTrc, MM281VPMgtE 在10 mM Mg2+ 的Nminimal培養(yǎng)基中的生長結(jié)果。M, 1 mM 時,表達(dá)了目的基因的菌株就會死亡，我們可以認(rèn)為VPMgtE有 Co2+ , Cd2+, Mn2+ , Zn2+ , Ni2+, Fe2+ , Cu2+離子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。M, 500 181。MM281pTrc,MM281VPMgtE在添加了不同Mg2+濃度的Nminimal互補(bǔ)平板上的生長結(jié)果.3．3. VPMgtE的表達(dá)改變了MM281的離子敏感性已有研究顯示,當(dāng)細(xì)菌中積累一定量的重金屬離子(如Co2+, Cd2+, Mn2+, Zn2+ )時，就會對細(xì)菌本身產(chǎn)生毒害作用并使之死亡。而陰性對照只能在10 mM的培養(yǎng)基中生長。由圖3(A)和 圖3(B)可知,表達(dá)了目的基因的MM281轉(zhuǎn)化子可在 100 181。從而使其可在含低濃度（10mM）Mg2+的培養(yǎng)基中生長。（見圖2）。表達(dá)了VPMgtE的MM281重組菌株可在低濃度 Mg2+情況下生長, 甚至在不加 Mg2+的LB培養(yǎng)基上生長。它只能在高濃度 Mg2+(100 mM)下達(dá)到最佳生長速度。 Human。：U18744。紅色方框表示突變后對其功能影響很大者，藍(lán)色表示對其功能影響較少者，綠色表示無影響。結(jié)果見圖1。其與Bacillus firmus OF4和Providencia %,%的相似性。 primer B,5’CAGACCGCTTCTGCGTTCTGATTT3’.名字 突變堿基 突變氨基酸 突變正向引物 突變反向引物 側(cè)翼引物 克隆位點(diǎn)（位置）VpJ1 953 Ala to Gly 5’AAATGGCGGGAATT 5’AAGACCGCAATTCC A/B SacI,KpnI （320） GCGGTCT3’ CGCCATT3’ VpJ2 992 Gly to Ala 5’CATCCATGGGTGCT 5’GTTACCTGCAACAG A/B SacI,KpnI （331） GTTGCAGGTAA3’ CACCCATGGA3’ VpJ3 1265 Aps to Ala 5’AGATGAATATCGCT 5’CAGCAAGGGCAGG A/B SacI,KpnI （422） CCTGCCCTTG3’ AGCGATATTCA3’ VpJ4 1267 Pro to Ala 5’AGATGAATATCGAT 5’CAGCAAGGGCAGC A/B SacI,KpnI（423） GCTGCCCTTG3’ ATCGATATTCA3’ VpJ5 51307 Asp to Ala 5’TGTGATTGGCTCGT 5’AGGAAAACAGACG A/B SacI,KpnI （436） CTGTTTTCCT3’ AGCCAATCACA3’ VpJ6 1316 Gly to Ala 5’GACTGTCACTGCTG 5’GACAAGCCAATCAC A/B SaI,KpnI （439） TGATTGGCTT3’ AGCAGTGACA3’ VpJ7 1319 Leu to Ser 5’TGTGATTGCCTTGT 5’AGGAAAACAGACAAA A/B SacI,KpnI （440） CTGTTTTCCT3’ GGCAATCACA3’3．結(jié)果與討論3．1. VPMgtE與MgtE基因家族其它成員相比顯示部分序列相似性VPMgtE的編碼一個含451個氨基酸的蛋白質(zhì)。突變引物設(shè)計(jì)見表1。從野生型VP MgtEpTrc99A中用高保真酶Pyrobest DNA polymerase 進(jìn)行三次PCR。37℃倒置培養(yǎng)2 d后觀察其生長情況并拍照。共測24 h。M,1 mM, 5 mM, 10 mM)和相應(yīng)抗生素的Nminimal培養(yǎng)基,將上述準(zhǔn)備好的培養(yǎng)物（起始OD600=～）加入Nminimal培養(yǎng)基中。M,100 181。2．6. 液體生長曲線挑取MM281，MM281pTrc， MM281VPpTrc的單菌落在含相應(yīng)抗生素的LB中搖菌,當(dāng)OD600=～,1200 rpm離心收集細(xì)胞,用去離子水清洗兩遍,以除去殘留的Mg2+,然后用去離子懸浮。取稀釋的菌液2 μl點(diǎn)樣于不同 Mg2+濃度的互補(bǔ)平板上, Al3+（以AlCl3的形式添加）毒害中點(diǎn)樣于pH5, Mg2+濃度為100 mM 的LB固體培養(yǎng)基上?！?加入1 mM/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo), ,取菌液100 μl加入900 μl水中。然后再按50:1 (50mL LB:1mL菌液)的比例接種于含有相應(yīng)抗生素的錐形瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。2．5. MM281的功能互補(bǔ)和鋁離子毒害實(shí)驗(yàn)將pTrc99AVPMgtE質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入MM281。2．4. 生物信息學(xué)分析的主要軟件及數(shù)據(jù)庫基因序列數(shù)據(jù)由NCBI中獲得。用高保真酶Pyrobest DNA polymerase 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)VPMgtE基因序列用Primer ,并添加酶切位點(diǎn)SacⅠ和KpnⅠ。pTrc99A由本室保存。 2．2. 載體，酶類及各種試劑盒pMD18T 載體和實(shí)驗(yàn)中用到的所有酶類均購自大連寶生物工程有限公司。副溶血弧菌于37℃LB中培養(yǎng)。為了更進(jìn)一步了解MgtE基因家族轉(zhuǎn)運(yùn) Mg2+的分子機(jī)制，我們從副溶血弧菌中克隆了一MgtE基因,將之稱為VPMgtE，并對其進(jìn)行了功能鑒定和定點(diǎn)突變等實(shí)驗(yàn)。基因組序列搜索顯示MgtE家族在古細(xì)菌，原核生物和真核生物中都有分布，但其分布的廣泛性不如 CorA家族。同時MgtE也具有Co2+, Cd2+, Mn2+ 等二價金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。MgtE的突變株和CorA一樣可增強(qiáng)對Co2+的抗性。其跨膜區(qū)的分布和CorA具相似性，都主要分布于C端，其N端位于胞質(zhì)區(qū)。MgtE基因家族首先在Bacillus firmus OF4中被Ronald等人在尋找新的CorA基因時發(fā)現(xiàn)。MgtA/+轉(zhuǎn)運(yùn)能力的基因，兩個都是大的復(fù)合跨膜蛋白，屬于P型磷酸酶家族。表明CorA基因廣泛分布于自然界中。CorA序列上存在保守基序GMN，是其轉(zhuǎn)運(yùn)Mg2+所必需的，若GMN基序中有一個氨基酸突變，其轉(zhuǎn)運(yùn)能力就會喪失[14]。目前,整個生物界中已發(fā)現(xiàn)有五大 Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)家族:CorA家族,Mg2+ /H+ 交換體,離子通道,P型磷酸酶和MgtE基因家族[3]。載體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)底物時是與其它物質(zhì)偶聯(lián)進(jìn)行的，具有和酶一樣的底物飽和性，編碼載體蛋白的基因的表達(dá)也常常受到外界底物濃度的影響，一般是在低底物濃度時，其基因的表達(dá)水平會提高。故離子進(jìn)出細(xì)胞必須通過膜上特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來實(shí)現(xiàn)。而同為豐富金屬離子的Ca2+ 和Na+的相應(yīng)半徑比卻只有25倍,K+ 的相應(yīng)半徑比最小,僅4倍。Mg2+具有獨(dú)特的化學(xué)特性, Mg2+具有最大的水合半徑,最小的離子半徑和最高的電荷密度。缺失足夠的 Mg2+,核糖體亞單位將會分離,同時細(xì)胞膜也會變成松弛滲漏的狀態(tài)。 副溶血弧菌。 關(guān)鍵詞: VP MgtE 。此外,該基因的表達(dá)也提高了該菌株對鋁毒害的抗性。我們克隆了該基因并將之命名為VP MgtE。10542_3_g_1目 錄1．湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科學(xué)生2002年以來發(fā)表論文和獲獎情況2．湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科學(xué)生研究創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)優(yōu)秀論文（報告）選編1．湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科學(xué)生2002年以來發(fā)表論文和獲獎情況（1）．發(fā)表的論文作者姓名專業(yè)年級論文（作品）名稱刊名稱和發(fā)表年份，卷（期）楊筱慧2000級生物科學(xué)湖南西部丘陵山區(qū)洪水成因的調(diào)查分析湖南教育學(xué)院學(xué)報 2002，20（5）何志恒1999級生物科學(xué)睡眠研究的科學(xué)前沿生命科學(xué)研究 2002，（21）羅小琳2000級生物科學(xué)心臟原基的起源和發(fā)育生命科學(xué)研究 2002，（21）鮑峰2000級生物科學(xué)心臟壁肌的發(fā)育生命科學(xué)研究 2002，（21）顏峰2000級生物技術(shù)時序調(diào)控小分子RNA的研究進(jìn)展生命科學(xué)研究 2002，（21）吳紅霞2000級生物科學(xué)脊椎動物心臟形態(tài)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控生命科學(xué)研究 2002，（21）孫亞蘭2000級生物科學(xué)miRNA—一類新的調(diào)控微小RNA生命科學(xué)研究 2002，（21）李莉1999級生物科學(xué)羰基毒化與阿爾茨海默病的相關(guān)性《老年癡呆發(fā)病機(jī)理與藥物研究》 盛樹力主編. 科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社出版 2003秦旺華1999級生物科學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究血瘀證本質(zhì)的現(xiàn)狀及進(jìn)展現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志 2004, 13 (20)向丹1998級生物科學(xué)冬眠烏龜體液與組織中可溶性蛋白質(zhì)的SDS電泳及熒光分析中國科學(xué)學(xué)報 2004, 1 (11)秦旺華1999級生物科學(xué)Biochenical relevance between oxidative/carbonyI strees and elevated viscosity of erythrocyte suspensionsCLINICAL HEMORHEOLOGY AND MICROCIRCULATION 2004, （2）秦旺華1999級生物科學(xué)血瘀證本質(zhì)與血液流變學(xué)和羰基應(yīng)激的相關(guān)性中華中西醫(yī)雜志 2004, 5 (21)陳雄1999級生物科學(xué)西方長壽與衰老研究史精要生命科學(xué)研究 2004, 8 (4)李小聰、易斌1999級生物技術(shù)The preparation and Catalytically active characterization of papain immobilized on magnetic Composite microspheresENZYME and MICROBIAL TECHNOLOGY 2004, 35: 1521鄔勇2000級生物技術(shù)維生素D受體雌激素受體a基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松的研究進(jìn)展中華老年醫(yī)學(xué)雜志 2005, 24 (6)李莉1999級生物科學(xué)Substantial reaction between histamine and malondialdehyde: A new observation of Carbonyl stressNeuroendocrinology letters 2005, 26 (6)王鑫慧2000級生物技術(shù)冬眠狀態(tài)烏龜尿液的生物學(xué)特性及生化分析湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報 2005, 3李莉1999級生物科學(xué)老年癡呆的發(fā)病機(jī)理與羰基應(yīng)激中華現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與臨床 2005, （7）向丹1998級生物科學(xué)從細(xì)胞復(fù)制衰老看動物整體衰老中國科學(xué)學(xué)報2005, 2 (2)秦旺華1999級生物科學(xué)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解阻抑與脂褐素形成和衰老的相關(guān)性中國老年學(xué)雜志社 2005, 25 (2)陳威華、鄧梅春、黎冠、康園2000級生物科學(xué)虎紋蜘蛛毒素—I對大鼠急性內(nèi)臟疼痛的抑制性效應(yīng)w芋螺毒素的比較研究（英文稿）中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報2005，21（1）陳威華、鄧梅春、黎冠、康園2000級生物科學(xué)一種新型N型電壓敏感性鈣通道拮抗劑虎紋蜘蛛毒素I對大鼠內(nèi)臟痛模型鎮(zhèn)痛作用的研究第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報2005，25（1）楊娜、周杰、鄔勇2000級生物技術(shù)No major effect of the insulinlike growth factor I gene on bone mineral density in premenopausal Chinese womenBONE 2005, 36: 694699佘巧玲2002級生物科學(xué)高中生物探究式實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)研究及案例分析生命科學(xué)研究 2006, 10（3）：149153劉連2002級生物基地人類高度進(jìn)化保守基因hnulp1中轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)段的定位生命科學(xué)研究 2006, 10（3）：194199劉連2002級生物基地hn