【正文】 ,000rpm離心2分鐘，務(wù)必將異丙醇 （或乙醇）除盡。 4. 加入500181。 3. 將混和液轉(zhuǎn)移入離心純化柱，13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。 對(duì)于高濃度的瓊脂糖凝膠（2%），加熱融膠的時(shí)間延長(zhǎng)到15分鐘。 2. 200mg~（使用前充分混勻），70℃保溫5~10分鐘，每?jī)煞昼婎嵉够靹?次，使瓊脂糖凝膠完全融化。盡量切掉不含DNA的瓊脂糖凝膠，這樣可簡(jiǎn)化操作、提高回收量及DNA片段的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容試劑與器材 試劑 (1)瓊脂糖 (2)TAE電泳緩沖液 (3)10DNA電泳樣品緩沖液 (4)無(wú)菌水 (5)PCR產(chǎn)物(6)溴化乙錠（EB）（7）試劑盒包裝及組成純化樹(shù)脂 （于GS結(jié)合液中）20ml離心純化柱（空柱子）50套（8）80%異丙醇或80%乙醇 （9）超純水或TE緩沖液儀器(1)臺(tái)式高速離心機(jī)(2)水浴鍋13(3)電泳器材實(shí)驗(yàn)步驟 1. 將無(wú)石蠟油的PCR反應(yīng)液或酶切反應(yīng)液（50μl~100181。其回收率分別為85%和70%左右?；驹硎牵诟啕}狀態(tài)下，純化樹(shù)脂專(zhuān)一性地吸附DNA；而在低鹽或水溶液狀態(tài)下，DNA被洗脫下來(lái)。結(jié)合后的DNA經(jīng)洗滌除去雜質(zhì)，最后在低鹽緩沖液中經(jīng)離心從纖維素上洗脫下來(lái)。～1kb的小分子片段，均有80％的回收率。向膠液中加入經(jīng)酸凈化處理的極細(xì)玻璃粉(乳)，室溫反復(fù)倒轉(zhuǎn)離心管使DNA吸附于其上。低熔點(diǎn)膠的另一個(gè)特點(diǎn)是電泳回收后可以立即進(jìn)行酶切連接、標(biāo)記等酶反應(yīng)，因?yàn)檫@類(lèi)膠中不含有普通瓊脂糖中抑制酶活性的硫酸鹽等雜質(zhì)，并且收集的膠條能在酶反應(yīng)的合適溫度(37℃)始終保持液體狀態(tài)。操作時(shí)可先灌一塊普通的膠，然后用低熔點(diǎn)膠取代其中的回收部分。 1．低熔點(diǎn)膠法 低熔點(diǎn)膠是向普通瓊脂糖的多糖鏈上引入羥乙基形成的，這一變化會(huì)使凝膠的熔化點(diǎn)與凝固點(diǎn)均降低。實(shí)驗(yàn)原理 DNA片段的分離與回收是基因工程操作中一項(xiàng)重要的技術(shù)，例如可收集特定酶切片段用于克隆或是制備探針，回收PCR產(chǎn)物用于再次鑒定等。+對(duì)Taq DNA聚合酶的活性影響很大，有時(shí)按照試劑商提供的說(shuō)明擴(kuò)增不出目的基因時(shí)，不妨適當(dāng)增加Mg2+的濃。紫外觀察，必要時(shí)拍照。（用舊式的PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增時(shí)還要求覆蓋約50μl (一滴)液體石蠟油，改進(jìn)后的PCR儀已經(jīng)不用液體石蠟油覆蓋。ddH2015μl10PCR Buffer2μldNTP(10mM each)Primer l(20μM)Primer 2(20μM)模板DNA (50ng)D16Pfu DNA聚合酶（） 1μl總體積 20μl對(duì)照水（空白對(duì)照） 3．混勻，短暫離心． 4．放在PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。2．試劑（1）50TAE電泳緩沖液（2）10PCR緩沖液：（3）4種dNTP混和液10mmol/L（4）Pfu DNA聚合酶（5U/μl）（5）引物（20μM）（6）10溴酚藍(lán)上樣緩沖液方法和步驟1. 在PCR儀上設(shè)置好程序。由于這種酶使用最早最廣泛，文獻(xiàn)中所列各項(xiàng)最適反應(yīng)條件都是針對(duì)此酶優(yōu)化的，使用其它的聚合酶時(shí)按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作。隨著引物濃度的降低，PCR反應(yīng)的特異性提高但產(chǎn)物得率降低；隨著引物濃度的升高，情況正好相反。使用較大量的模板時(shí)，循環(huán)數(shù)可減少；如果模板量很少，可能需要增加至45個(gè)循環(huán)反應(yīng)。每個(gè)PCR反應(yīng)中加入的模板數(shù)量可在102～105分子之間，必要時(shí)可低至50個(gè)分子，模板的量少時(shí)應(yīng)酌情增加循環(huán)次數(shù)。2．模板 PCR模板可以是DNA或RNA，RNA需反轉(zhuǎn)錄后再擴(kuò)增。如5mmol／L的二硫蘇糖醇(DTT)，100μg／ml的小牛血清白蛋白(BSA)％的明膠。而Tricine的溫度系數(shù)較高，在擴(kuò)增長(zhǎng)片段時(shí)用Tricine系統(tǒng)。 (4)pH值：PCR反應(yīng)中用的是TrisHCL緩沖系統(tǒng)。但不是所有的聚合酶都能接受經(jīng)過(guò)修飾的dNTP。dNTP的用量與PCR產(chǎn)量及產(chǎn)物忠實(shí)性有關(guān)，dNTP量過(guò)少時(shí)合成的產(chǎn)物減少。Mg2+～／L，／L梯度間隔做Mg2+最適濃度試驗(yàn)。由試劑公司與Taq酶一起提供。由于影響引物設(shè)計(jì)的因素比較多，所以常利用計(jì)算機(jī)來(lái)輔助設(shè)計(jì)，通常可用primer 。7．二引物的Tm值 引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意使二引物的Tm值相近，否則二個(gè)引物必然不能同時(shí)達(dá)到最佳退火溫度，將會(huì)影響PCR擴(kuò)增效果。二引物間不能配對(duì)的道理與二引物本身不能配對(duì)相同，若發(fā)生這種情況會(huì)形成引物二聚體，造成擴(kuò)增失敗。 5．引物無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu) 引物自身應(yīng)無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu)。另一種理論是3′末端應(yīng)設(shè)計(jì)為G或C，因?yàn)镚和C的氫鍵多于A與T，能更好地與模板結(jié)合開(kāi)始DNA合成，當(dāng)然對(duì)錯(cuò)配延伸效率方面就不能苛求了。 4．引物3′端起始?jí)A基 Taq酶在3′末端錯(cuò)配時(shí)延伸效率是不一樣的，延伸效率為T(mén)G＝CA。GC比過(guò)高與過(guò)低都會(huì)直接造成Tm值的過(guò)高與過(guò)低。當(dāng)然若要在引物的5＇末端加上特定的酶切位點(diǎn)等堿基則可稍長(zhǎng)。引物過(guò)短時(shí)造成Tm值過(guò)低，不能與模板很好地配對(duì)或是配對(duì)專(zhuān)一性很低。所以Ta的選擇應(yīng)滿(mǎn)足TE25℃TaTE。這個(gè)溫度范圍應(yīng)不高于酶的最適反應(yīng)溫度，也不能比TE－25℃更低。合適的引物選擇應(yīng)需考慮到以下因素，如Taq酶的最適溫度(TE)和Tm值等。理論上，經(jīng)過(guò)n次循環(huán)可使特定片段擴(kuò)增到2n1，考慮到擴(kuò)增效率不可能達(dá)到100％，實(shí)際上要少些，通常經(jīng)25～30次循環(huán)可擴(kuò)增106倍，這個(gè)量足夠分子生物學(xué)研究的一般要求。PCR反應(yīng)由一系列的變性——退火——延伸反復(fù)循環(huán)構(gòu)成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低的溫度下同過(guò)量的引物退火，再在適中的溫度下由DNA聚合酶催化進(jìn)行延伸。 PCR的原理是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸(dNTP)存在的條件下，依賴(lài)于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)原理 PCR(polymerase chain reaction)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng)。5．實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿、微量吸管及Eppendorf管等，應(yīng)徹底洗凈并進(jìn)行高壓消毒，表面去污劑及其他化學(xué)試劑的污染往往大幅度地降低轉(zhuǎn)化率。3．42℃熱處理時(shí)間很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準(zhǔn)確，同時(shí)注意熱處理過(guò)程中離心管不要搖動(dòng)。注意事項(xiàng) 1．致敏緩沖液中試劑的純度與濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率影響很大，試劑必須為分析純，同時(shí)，致敏緩沖液最好避光貯存于40C。平板在37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。（轉(zhuǎn)速不低于225RPM） 11．5000r／min離心1min, 棄去上清液保留培養(yǎng)基100～200μl，充分懸浮細(xì)菌，分別涂布于含氨芐青霉素的LB平板，加入的菌液用玻棒均勻推開(kāi)。 9．。 （%的無(wú)菌甘油70℃保存）6．取3支1．5ml離心管，按下表加試劑和操作：試 劑管1管2管3連接產(chǎn)物10μl質(zhì)粒(100ng／μ1)1μlH2O9μl10μl感受態(tài)細(xì)胞200μl200μl200μl 7．冰浴中放置30min。 4. 沉淀的菌體懸浮于20m1 ／L冷CaCl2內(nèi)，冰浴中放置30min，4℃4000r／min離心8 min。2．從LB平板上挑取DH5a單個(gè)菌落接種在5ml LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 7．培養(yǎng)皿及1．5ml離心管等。 5．LB平板 ％瓊脂粉，高壓消毒(15磅20min)，稍冷卻后鋪平板。 3．100mmol／L CaCl2，用純水配制。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容試劑與材料 1．菌株 DH5a等。⑤菌株基因型recA+與recA—的影響：recA基因是rec系列中最主要的基因，編碼同源重組蛋白。④質(zhì)粒大小、構(gòu)型的影響：通過(guò)構(gòu)建相同復(fù)制起點(diǎn)的不同大小質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，從2kb到3．2kb的轉(zhuǎn)化效率上升，此后到66kb轉(zhuǎn)化效率線性下降。②CaCl2法0℃放置時(shí)間的影響：細(xì)菌經(jīng)0℃ CaCl2處理后轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加，24h達(dá)到最高，之后轉(zhuǎn)化率逐漸下降。影響轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素：①生長(zhǎng)時(shí)期：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在對(duì)數(shù)中期的大腸桿菌易生成感受態(tài)。轉(zhuǎn)化效率是衡量菌體處于感受態(tài)的細(xì)胞多少的指標(biāo)，一般定義為1μg環(huán)狀質(zhì)粒DNA在感受態(tài)細(xì)胞過(guò)量的情況下產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子的個(gè)數(shù)。常用的轉(zhuǎn)化方法1．化學(xué)法轉(zhuǎn)化 包括了CaCl氯化鈣／氯化銣、MgCl2等方法，所有化學(xué)法轉(zhuǎn)化均需制備感受態(tài)細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)四 感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備 實(shí)驗(yàn)五 重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握CaCl2制備感受態(tài)大腸桿菌的方法和化學(xué)轉(zhuǎn)化法。插入的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序時(shí)，可使用何種引物?本制品的載體來(lái)源于pUC18載體。6. 最好使用新配制的平板培養(yǎng)基。4. 確認(rèn)Ligation Solution I 的連接效率是否降低，多次反復(fù)凍融會(huì)降低的Ligation Solution I 連接效率。2. PCR產(chǎn)物中短片段雜質(zhì)DNA太多，這時(shí)應(yīng)切膠回收純化DNA片段，回收時(shí)PCR產(chǎn)物不要在紫外線下暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。端是否附加了A。一般情況下，大片段DNA的克隆效率（連接效率與轉(zhuǎn)化效率）小于短片段DNA，在使用大片段DNA的連接液進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，建議采用電轉(zhuǎn)化方法。切膠回收的PCR片段最好2. 除去殘存的引物等雜質(zhì)。7. 感受態(tài)細(xì)胞可使用適合于pUC系列載體的感受態(tài)細(xì)胞，如：JM109，DH5a等。5. 連接反應(yīng)請(qǐng)?jiān)?6℃下進(jìn)行，溫度升高 (26℃) 較難形成環(huán)狀DNA。4. 按照本實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行連接后，直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)的連接液不要超過(guò)20 ml。在本制品中， pMD18T Vector 1 ml (50 ng) pmol，Control Insert DNA 1ml (50 ng) pmol。注意事項(xiàng)：1. Ligation Solution I 請(qǐng)于冰中融解。計(jì)數(shù)白色、藍(lán)色菌落。3. 全量 (10ml) 轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞 (100 ml)中。實(shí)際操作時(shí)，可按實(shí)驗(yàn)需要使用適量的T載體。操作步驟1. 在微型離心管中制備下述連接反應(yīng)液，全量為10 ml。IPTG，Xgal，LB培養(yǎng)基等。當(dāng)外源DNA片斷插入到多克隆位點(diǎn)后，就會(huì)破壞α肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內(nèi)的β半乳糖苷酶相互補(bǔ)的活性α肽鏈，而導(dǎo)致不能形成功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重組質(zhì)粒載體的克隆往往是白色的，而沒(méi)有插入外源片斷的則是藍(lán)色的。當(dāng)二者產(chǎn)物組合在一起，就具有活性酶的產(chǎn)生，此現(xiàn)象稱(chēng)為α互補(bǔ)。α互補(bǔ)和藍(lán)白篩選的原理：許多載體（包括pMD18T）都具有一段大腸桿菌β半乳糖苷酶的啟動(dòng)子和編碼其N(xiāo)端氨基酸（α肽鏈）的片斷基因。用途：克隆PCR產(chǎn)物。此外，本制品中的高效連接液Ligation Solution I 可以在極短的時(shí)間內(nèi) (30分鐘1小時(shí)) 完成連接反應(yīng)，大大地方便了實(shí)驗(yàn)操作。末端添加一個(gè)“A”的特性,所以使用本制品可大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。端添加“T”而成。它是TaKaRa獨(dú)自研究開(kāi)發(fā)，由pUC18載體改建而成的。 下圖是大連寶生物公司的T載體及其說(shuō)明書(shū)。由于在PCR過(guò)程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分為2種情況：（1）使用不同的Taq酶，在PCR擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，加上72℃ 10分鐘一個(gè)過(guò)程，Taq酶可以在擴(kuò)增產(chǎn)物的3末端加上A，因此PCR產(chǎn)物回收純化后可以和T載體直接連接。106 Dalton1 OD260nm=40mg附錄二、瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA的最適分辨范圍瓊脂糖凝膠濃度線性DNA的最適分辨范圍（bp）%%%%%%1，00030,00080012,0005001,0004007,0002003,000502,000實(shí)驗(yàn)三 PCR產(chǎn)物的TA克隆實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆胀ㄟ^(guò)TA連接克隆PCR產(chǎn)物的原理和方法。106 Dalton1 OD260nm=50mgssDNA10kb=180。2 換算出OD260/OD280的比值，較純的DNA。濃度和純度分析：1 取10μl DNA 用TE緩沖液稀釋至1ml，混勻。注意：長(zhǎng)度以?xún)蓚€(gè)電極之間的距離計(jì)算。(10)接通電源，DNA樣品往正極移動(dòng)。(8) 取5μl實(shí)驗(yàn)一制備的質(zhì)粒DNA，在DNA樣品中加入1／10的上樣緩沖液并混勻。(6) 取掉模具兩端的膠布，放入電泳槽，加樣孔在負(fù)極端。室溫下15～30min后，瓊脂糖溶液完全凝固。(3) 凝膠冷至60℃左右，／m1。2．器材(1)恒溫水浴(2)電泳槽(3)電泳儀(4) 微波爐(5)紫外線檢測(cè)儀(6)移液器；1001000μl， 10100μl,操作步驟電泳(1) g瓊脂糖，加入100ml 1TAE電泳緩沖液中。(5)50TAE電泳緩沖液。(3)10mg／ml溴乙錠溶液。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：試劑(1)質(zhì)粒pNTEEGFP。／m1的EB溶液染色1015min后進(jìn)行紫外觀察，由于EB在可見(jiàn)光下易分解，故應(yīng)存棕色瓶中于4℃條件下保存。EBDNA復(fù)合物中的EB發(fā)出的熒光，比游離的凝膠中的EB本身發(fā)出的熒光強(qiáng)大10倍，因此不需要洗凈背景就能清楚地觀察到核酸的電泳帶型。3．染色劑 核酸需經(jīng)過(guò)染色才能顯示出帶型，最常用的是溴乙錠染色法。％，1％，2％的瓊脂糖凝膠中，溴酚藍(lán)的遷移率分別與1kb。2．指示劑 電泳過(guò)程中，常使用一種有顏色的標(biāo)記物以指示樣品的遷移過(guò)程。DNA電泳緩沖液，常采用偏堿性或中性條件，使核酸分子帶負(fù)電荷，向正極泳動(dòng)。由于Cl—的泳動(dòng)速度比樣品分子快得多，易引起帶型不均一現(xiàn)象，所以常利用TAE、TBE和TPE三種緩沖體系。電壓1000～2000V，電場(chǎng)強(qiáng)度20～600V／cm的電泳為高壓電