【正文】 陽(yáng)性克隆重新在 SD/Ade/His/Leu/Trp培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng) β半乳糖苷酶濾膜影印法初步篩選出陽(yáng)性候選克隆的轉(zhuǎn)化株 2 結(jié)果 文庫(kù)的擴(kuò)增與抽提 文庫(kù)滴度為 109 cfu /ml ； 文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率為 105 cfu/μg ； 共得轉(zhuǎn)化子約 107 β半乳糖苷酶濾膜影印分析法鑒定的真陽(yáng) 性克隆結(jié)果 138個(gè)克隆呈現(xiàn)藍(lán)色，為陽(yáng)性候選克隆 3 討論 ?酵母株 AH109的表型 (Ade， His， Leu， Trp ） 及用以篩選的原理 ?酵母篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性 ?高嚴(yán)謹(jǐn)性 ?低嚴(yán)謹(jǐn)性 ?最低嚴(yán)謹(jǐn)性 第二部分 相互作用蛋白的進(jìn)一步確證、 cDNA序列測(cè)定及其同源性分析 pGADT7Rec AD 載體 共轉(zhuǎn)化感受態(tài) 酵母菌 AH109 總 RNA HL60細(xì)胞 HL60細(xì)胞 cDNA文庫(kù) 人 CK2α39。 ? 酵母 URA3基因產(chǎn)物一方面為合成尿嘧啶所必需，同時(shí)又能催化 5FOA（ 5氟乳清酸）轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘晕镔|(zhì)。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補(bǔ)充，提出了創(chuàng)建整個(gè)有機(jī)體蛋白質(zhì)連鎖圖譜的設(shè)想。 反向酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 ? 用于篩選缺陷等位基因的研究 在穩(wěn)定、全長(zhǎng)及能夠形成正確蛋白質(zhì)折疊的條件下，已有了幾種遺傳學(xué)策略來(lái)篩選作用缺陷性等位基因。 ? 利用這種方法能方便地鑒定 作用缺陷等位基因 、 解離肽或相關(guān)的小分子物質(zhì) 。 ? 在這系統(tǒng)中，野生型 BDX/ADY間的相互作用激活一種 毒性標(biāo)志 作為報(bào)告基因，對(duì)酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的 陰性 篩選。 ③定位已經(jīng)證實(shí)的具有相互作用的 DNA結(jié)合蛋白的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及準(zhǔn)確定位與 DNA結(jié)合的核苷酸序列。 酵母單雜交系統(tǒng)應(yīng)用 ① 確定已知 DNA蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。 ? 該系統(tǒng)不僅適用于識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子，也適用于研究參與轉(zhuǎn)錄抑制和 DNA復(fù)制過(guò)程的蛋白質(zhì)。 ? 靶 DNA序列特異的結(jié)合蛋白 (BDPX)與 Gal4 P的激活結(jié)構(gòu)域可融合形成融合體， BDPX與其特異 DNA結(jié)合位點(diǎn)之間通過(guò)相互作用可激活作為表型選擇性標(biāo)志的報(bào)告基因的表達(dá)。 Wang MM, Reed RR. Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf1 by geic selection in yeast. Nature， 1993， 364(6433):121126. 文獻(xiàn)出處 酵母單雜交系統(tǒng)原理 ? 在酵母單雜交系統(tǒng)中，省略了在酵母雙雜交系統(tǒng)中采用的 BDX蛋白質(zhì)雜交體，而用特異的DNA序列取代 DNA Gal4結(jié)合位點(diǎn)。 在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展： ?酵母單雜交 用于核酸和文庫(kù)蛋白之間的研究 ?酵母三雜交 三種不同蛋白之間的互作研究 ?酵母的反向雜交 兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)。這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究 陽(yáng)性克隆必須進(jìn)行體外翻譯和表達(dá)，用抗原表位特異性的抗體進(jìn)行共定位研究。 酵母雙雜交系統(tǒng) 局限性 3. 有時(shí) DNABD或 AD融合部分不包括相互作用位點(diǎn)，或破壞了融合蛋白的正確折疊。在細(xì)胞表面發(fā)生的相互作用可采用 噬菌體顯示系統(tǒng) 。 六、酵母雙雜交系統(tǒng)使用注意事項(xiàng) 酵母雙雜交系統(tǒng) 局限性 1. 某些誘餌蛋白具有 自身激活 性質(zhì)。 兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報(bào)告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測(cè)不出來(lái)。 辦法 ： 引進(jìn)酵母接合型 a接合型和 ?接合型（兩者之間可，但自身不能形成二倍體） （二） 轉(zhuǎn)化效率偏低 ?接合型酵母細(xì)胞 cDNA文庫(kù) 誘鉺蛋白基因 多克隆位點(diǎn) DNABD 載體 AD 載體 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化 a接合型酵母細(xì)胞 篩選平板生長(zhǎng)菌苔 篩選平板生長(zhǎng)菌苔 同一個(gè)三重篩選平板 克?。ㄕT餌與靶蛋白相互作用） 鑒定 β半乳糖苷酶 部分已商品化 （三）陰性干擾 ?融合蛋白的表達(dá) 對(duì)細(xì)胞有毒性 ， 該怎么辦？ 應(yīng)選擇 敏感性較低 的菌株或拷貝數(shù)低的載體 ?蛋白間的 相互作用較弱 ，應(yīng)選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。 ③一些實(shí)際沒(méi)有相互作用的蛋白但有相同的模體蛋白也可發(fā)生相互作用。 進(jìn)一步分析： ① 這種相互作用是否會(huì)在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生。 ④優(yōu)化 3AT(3aminotriazole)濃度。目前試劑公司已采用。應(yīng)對(duì)誘餌和靶蛋白分別作單獨(dú)激活報(bào)告基因的鑒定。 ③ AD融合蛋白直接與轉(zhuǎn)錄因子相互作用激活報(bào)告基因； ④ AD融合靶蛋白與 BD相互作用或者 AD與 BD融合蛋白之間的相互作用，尤其是后者帶來(lái)許多假陽(yáng)性。這種融合蛋白的激活作用被外來(lái)蛋白激活。 五、酵母雙雜交系統(tǒng)中常見(jiàn)問(wèn)題的解決和改進(jìn)措施 （一） 假陽(yáng)性較多 （二） 轉(zhuǎn)化效率偏低 （三） 陰性干擾 ? 假陽(yáng)性定義 在待研究的兩個(gè)蛋白間沒(méi)有發(fā)生相互作用的情況下，報(bào)告基因仍被激活 。 利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和 EST序列為誘餌，在表達(dá)文庫(kù)中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。 利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖 （ Genome Protein Linkage Map） 基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。而在 細(xì)胞體內(nèi) 的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過(guò)酵母雙雜交進(jìn)行檢測(cè)。 ? 繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜 ? 在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用 四、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀 利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì) 的新功能 將已知基因作為 誘餌 ，在選定的 cDNA文庫(kù)中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽(yáng)性酵母菌株中可以分離得到 AD文庫(kù)載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的 cDNA片段，并對(duì)該片段的編碼序列在 GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。 ? 分析新基因的生物學(xué)功能。 ? 分析已知蛋白之間的相互作用 ? 對(duì)蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行點(diǎn)突變或缺失突變?cè)龠M(jìn)行雙雜交。 4. 廣泛性。 3. 簡(jiǎn)潔性。 2. 真實(shí)性。 原因： ①采用高拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體，使融合蛋白過(guò)量表達(dá)； ②激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，之后又與啟動(dòng)子結(jié)合，此