【正文】 組織培養(yǎng) 細(xì) 胞在促融因子的作用下，出 現(xiàn) 凝集 現(xiàn) 象，然后， 細(xì) 胞之 間 的 質(zhì) 膜 發(fā) 生粘 連 ， 細(xì) 胞 開 始 細(xì) 胞質(zhì) 融合 ，然后在培 養(yǎng)過 程中， 進(jìn) 而 發(fā) 生 核融合 ，形成 雜種細(xì) 胞。 連續(xù)式培養(yǎng) 連續(xù)式培養(yǎng)：指在培養(yǎng)過程中 ， 以不斷抽取懸浮培養(yǎng)物并注入等量新鮮培養(yǎng)基 ， 使培養(yǎng)物不斷得到養(yǎng)分補(bǔ)充 ， 保持反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài) 。半連續(xù)培養(yǎng)能夠重復(fù)獲得大量均一的培養(yǎng)細(xì)胞供進(jìn)一步利用 。 流加式培養(yǎng)是指先將終體積 1/3~1/2的 培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，隨著細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營養(yǎng)成分又不斷補(bǔ)充至反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞持續(xù)生長代謝，到反應(yīng)終止時取出整個反應(yīng)系。 特點(diǎn)： ?分批式培養(yǎng)過程的環(huán)境隨時間變化很大 ?細(xì)胞的生長階段可分為延滯期 、 對數(shù)生長期 、 減速期 、 平穩(wěn)期和衰退期 。 Hanks液、 Earle液和 PBS液等 4. 營養(yǎng)物質(zhì) 糖、 氨 基酸、促生 長 因子、無機(jī) 鹽 、微量元素、激素以及 動 物或人血 清 等。 四、動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù) 1. 無菌、無毒的環(huán)境 添加一定量的抗生素，定期更 換 培 養(yǎng) 液。包括 原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期 及 衰退期 。生長位置不固定，分散，呈活躍的的游走和變形運(yùn)動。排列成放射狀，漩渦狀，不連成片。 體內(nèi)：粘附是全方位，外形具有復(fù)雜的立體特征 體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個附著平面，外形一般與體內(nèi)時明顯不同 細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式存在差異 上皮細(xì)胞型 成纖維細(xì)胞型 游走細(xì)胞型 多型性細(xì)胞型 培養(yǎng)動物細(xì)胞形態(tài) 類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞， 扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核 。 細(xì)胞接觸抑制 細(xì)胞在貼壁生長過程中，細(xì)胞間相互接觸，細(xì)胞分裂和生長停止的現(xiàn)象。 懸浮型細(xì)胞 :不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。 有限細(xì)胞系轉(zhuǎn)換成永久細(xì)胞系的過度期稱為轉(zhuǎn)換期，其轉(zhuǎn)換過程在動物細(xì)胞培養(yǎng)中稱為體外轉(zhuǎn)化 。 從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選方法， 由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群 ，稱 細(xì)胞株 。 原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng) 用胰蛋白酶將出現(xiàn)接觸抑制的貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，制成細(xì)胞懸液，分裝到多個培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，這個過程叫 傳代培養(yǎng) 。 幼 齡 動物幼 齡 動物剪碎組織剪碎組織胰 蛋白酶處理單個細(xì)胞原代細(xì)胞培 養(yǎng)原代細(xì)胞培 養(yǎng)取動物器官和組織取動物器官和組織細(xì)胞懸浮液細(xì)胞懸浮液傳代細(xì)胞培 養(yǎng)幼 齡 動物幼 齡 動物 剪碎組織剪碎組織胰 蛋白酶處理單個細(xì)胞原代細(xì)胞培 養(yǎng)原代細(xì)胞培 養(yǎng)取動物器官和組織取動物器官和組織細(xì)胞懸浮液細(xì)胞懸浮液傳代細(xì)胞培 養(yǎng)二、動物細(xì)胞培養(yǎng) ： 動物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動物機(jī)體中取出相關(guān)的組織 ,將它分散成單個細(xì)胞 ,然后 ,放在適宜的培養(yǎng)基中 ,讓這些細(xì)胞生長和增殖 ,并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。 1962年，英國學(xué)者 Grudon把非洲 爪蟾小腸上皮細(xì)胞的核 注入同種或異種非洲爪蟾未受精卵 (經(jīng)紫外線照射殺死卵細(xì)胞核 )中，約有 1％的重組卵發(fā)育成為成熟蛙 。 4. 動物克隆技術(shù)的建立 1891， Heape等人首次報道了家 兔胚胎移植成功的結(jié)果。 Lifflefield(1964)根據(jù)親本細(xì)胞的酶缺陷型，利用選擇性培養(yǎng)基 篩選異型融合細(xì)胞 ，并能不斷地 增殖 。 1951年， Gay建立了第一個 人體細(xì)胞系 . 3. 細(xì)胞融合技術(shù)的建立和雜交瘤技術(shù)的誕生 1958年 , Okada發(fā)現(xiàn)紫外滅活的 仙臺病毒 可引起艾氏腹水瘤細(xì)胞彼此融合。 1914年， Thomson創(chuàng)立了 器官培養(yǎng)法 ，以后被 Strangeways和 Fell所發(fā)展。 2. 動物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立 1907年， R. Harrison將 蛙的胚神經(jīng)管區(qū)的一片組織 移植到蛙的淋巴液凝塊中，這片組織 存活了若干星期 ，而且還 長出了軸突 (神經(jīng)纖維 )細(xì)胞。 1．融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn) 一、 動物物細(xì)胞工程的發(fā)展 1859年， A. Barli在研究黏蟲的生活史時發(fā)現(xiàn)，某些黏蟲存在著由單個核細(xì)胞融合形成多核的原生質(zhì)團(tuán)的情況。 第三 節(jié) 、 動 物 細(xì) 胞培 養(yǎng) 技 術(shù) 19世紀(jì) 30年代， Muller, Schwann, Virchow等相繼在肺結(jié)核、天花、水痘、麻疹等病理組織中觀察到 多核細(xì)胞 現(xiàn)象。膜具有選擇性，有利于產(chǎn)品分離。 膜反應(yīng)器 優(yōu)點(diǎn)：可以重復(fù)使用。 典型的流化床反應(yīng)器是利用液體或氣體的流動使支持物顆粒處于懸浮狀態(tài)。 填充床反應(yīng)器 Jones 在填充床反應(yīng)器中進(jìn)行了固定化胡蘿卜的培養(yǎng)， Kargi 采用這種反應(yīng)器培養(yǎng)長春花 流化床反應(yīng)器 優(yōu)點(diǎn)：良好的傳質(zhì)特性。 缺點(diǎn)：由于其混合效果低，對必要的氧傳遞， pH值、溫度控制和氣體產(chǎn)物 (如C02)的排除造成了困難。 2)固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器 固定化細(xì)胞：將一定生理功能的生物體用物理或化學(xué)方法使其與適當(dāng)載體相結(jié)合，作為固體催化劑利用。但 過量的通氣易排除培養(yǎng)液中的二氧化碳和乙烯 ，對于細(xì)胞生長有阻礙作用。 不足：因氣體攪拌強(qiáng)度低， 高密度培養(yǎng)時混合不夠均勻 。 我國的劉大陸、查麗杭等發(fā)明了“氣升內(nèi)錯流式”植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器用于培養(yǎng)紫草，紫草寧含量達(dá)到了干細(xì)胞重的 10%，是天然植株的 28倍。 存在的問題：主要問題是 剪切力問題 ；對只需較低 kLa的植物細(xì)胞培養(yǎng)，促進(jìn)氧傳遞的機(jī)械攪拌，每 單位體積消耗的功率比氣體攪拌要大 ；機(jī)械攪拌需攪拌軸，由此又帶來了 無菌密封 問題。 Fujita利用這種反應(yīng)器生產(chǎn)紫草寧。 固定化培養(yǎng)技術(shù) （ 1）有利于次生物質(zhì)的合成、積累； （ 2） 減弱剪切力損傷； （ 3）有利于連續(xù)培養(yǎng)和產(chǎn)物的收集； 固定化培養(yǎng)優(yōu)勢 1）懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的初期（ 20世紀(jì) 70年代），主要采用微生物培養(yǎng)用的機(jī)械攪拌反應(yīng)器。 3）能充分保證氧的供給。 幾種流體特征 1賓漢型 2假塑性 3牛頓型 4漲塑性 1漲塑性 2牛頓型 3假塑性 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 懸浮培養(yǎng)優(yōu)勢 把離體的植物細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng) 1）培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)接觸面大，傳質(zhì)效果好。 ⑥ 植物細(xì)胞的需氧量要比微生物要低的多。 ③ 植物細(xì)胞生長速度慢，操作周期長 ④ 多泡沫。 冠癭瘤培養(yǎng) 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)在食品工業(yè)中的應(yīng)用 （ 1）利用植物細(xì)胞工程生產(chǎn)香料 （ 2）生產(chǎn)食品添加劑 （ 3）生產(chǎn)天然食品 七、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的特點(diǎn) ① 植物細(xì)胞對剪切力敏感。 誘導(dǎo)物： 一類能引起植物細(xì)胞代謝強(qiáng)度變化或代謝途徑改變的物質(zhì)。 缺點(diǎn)： 培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持， pH變動幅度大，培養(yǎng)細(xì)胞僅能短期分裂。 微室培養(yǎng) 在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖成細(xì)胞團(tuán)的方法。篩選效率高、篩選量大、操作簡便。 將懸浮單細(xì)胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合后平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)法。 優(yōu)點(diǎn)： 簡便易行，效果好。 秋水仙堿、 2， 4－ D或 LH。 化學(xué)法 利用利用化學(xué)藥劑使細(xì)胞分離的方法。 加滲透壓保護(hù)劑如 甘露醇 以防酶對細(xì)胞的損傷。缺點(diǎn)：手工操作難度大，獲得完整的細(xì)胞數(shù)量少。其外觀一般是