【正文】 一個(gè)起點(diǎn)，兩個(gè)復(fù)制叉，雙向復(fù)制。 ?細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng) 是 DNA復(fù)制高度忠實(shí)性的重要因素。這些新合成的 DNA為單鏈 。 目 錄 ?端粒酶（ telomerase） 是一種核糖核蛋白（ RNP），由 RNA和蛋白質(zhì)組成。 ?這些重復(fù)序列多為雙鏈，但每個(gè)染色體的 3’端比5?端長，形成單鏈 ssDNA。 目 錄 ?端粒（ telomeres） 由富含 TG的重復(fù)序列組成。 目 錄 (六 )端粒酶確保染色體末端復(fù)制完整 前導(dǎo)鏈 產(chǎn)生 完整的子染色單體。 但在 S、G2和 M期 ， 高活性的 Cdk抑制 preRC的其他組分結(jié)合 ORC。 Cdk功能： 目 錄 在每個(gè)細(xì)胞周期過程中 ， 僅有一次機(jī)會(huì)形成preRC， 也僅有一次機(jī)會(huì)激活 preRC。 目 錄 preRC的激活和組裝真核DNA復(fù)制叉 目 錄 （ 1）激活 preRC，以起始 DNA復(fù)制； （ 2）抑制形成新的 preRC。 ?DNA聚合酶在復(fù)制起點(diǎn)按一定順序組裝：首先Pol ?和 Pol ?結(jié)合，然后是 Pol ?/引發(fā)酶。 三種蛋白質(zhì)一起募集真核細(xì)胞解旋酶 Mcm27。 目 錄 ORC至少募集兩種解旋酶加載蛋白 Cdc6和 Cdt1。 在原核細(xì)胞中，復(fù)制基因的識別與 DNA解旋、募集 DNA聚合酶偶聯(lián)進(jìn)行。 目 錄 ? 復(fù)制基因的選擇 出現(xiàn)于 G1期 ，基因組的每個(gè)復(fù)制基因位點(diǎn)均組裝 前復(fù)制復(fù)合物（ prereplicative plex， preRC） 。 (五 ) 真核染色體在每個(gè)細(xì)胞周期中只能復(fù)制一次 目 錄 1. 前復(fù)制復(fù)合物在 G1期形成而在 S期被激活 真核細(xì)胞 DNA復(fù)制的起始分兩步進(jìn)行，即 復(fù)制基因的選擇 和 復(fù)制起點(diǎn)的激活。 (四 ) 切除 RNA引物有兩種機(jī)制 解旋酶 Dna2具有依賴 DNA的 ATPase和 3??5?解旋酶活性 ， 其解旋作用可以使前一個(gè)岡崎片段的 5?端引物形成“ 蓋子 ” 結(jié)構(gòu) ， 再由 FEN1的內(nèi)切酶活性切除引物 。 ? 引發(fā)體組裝 包括 DNA解旋酶 與 Pol ?/引發(fā)酶 相互作用。 目 錄 DNA復(fù)制需要 DNA解旋酶打開 DNA雙螺旋，使復(fù)制模板鏈得以暴露 。 ?FEN1參與去除岡崎片段 5?端的 RNA引物。 4. PCNA是可滑動(dòng)的 DNA夾子 增殖細(xì)胞核抗原 （ proliferating cell nuclear antigen， PCNA） 結(jié)構(gòu)： 功能： 同源三聚體，可形成閉合環(huán)形的可滑動(dòng)DNA夾子。 ? PCNA水平是檢測細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)。 RFC的功能： 目 錄 ? PCNA是 Pol ?的進(jìn)行性因子，使 Pol ?獲得持續(xù)合成能力。 二、真核生物 DNA復(fù)制和原核生物相似但更為復(fù)雜 真核生物與原核生物 DNA復(fù)制的差異： 目 錄 (一 )常見的真核細(xì)胞 DNA聚合酶有 5種 A家族 與大腸桿菌 PolⅠ 同源 ， 包括 Pol ?和 Pol ? B家族 與大腸桿菌 Pol Ⅱ 同源 ， 包括 Pol ?、 ?、 ?和 ζ C家族 與大腸桿菌 Pol Ⅲ 同源 ， 僅在真菌中發(fā)現(xiàn) X家族 與大腸桿菌 DNA聚合酶并無同源性 ， 卻與末端轉(zhuǎn)移酶同源 ， 成員包括 Pol ?、 ?、 ? Y家族 （ UmuC/DinB超家族 ） ， 近年發(fā)現(xiàn)一個(gè)特殊的真核及原核 DNA聚合酶家族 ， 成員包括 Pol ?、 ?、 ?和 Rev1 目 錄 Pol ?負(fù)責(zé)合成引物 Pol ?負(fù)責(zé) DNA復(fù)制、核苷酸切除修復(fù)和堿基切除修復(fù) Pol ?的功能與 Pol ?相似（其確切功能尚待定） Pol ?可能和堿基切除修復(fù)有關(guān) Pol ?負(fù)責(zé)線粒體 DNA復(fù)制和損傷修復(fù) 常見的真核 DNA聚合酶有 5種： 目 錄 拓?fù)洚悩?gòu)酶，去除負(fù)超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除復(fù)制叉前方產(chǎn)生的正超螺旋 TolⅠ 和 TolⅡ DNA雙螺旋解鏈，參與組裝引發(fā)體 DNA解旋酶 連接岡崎片段 DNA連接酶 Ⅰ 核酸酶，切除 RNA引物 RNAse HⅠ 核酸酶，切除 RNA引物 FEN1 DNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù) Pol ?/? 合成 RNADNA引物 Pol ?/引發(fā)酶 有依賴 DNA的 ATPase活性，結(jié)合于引物 模板鏈，激活 DNA聚合酶， 促使 PCNA結(jié)合于引物 模板鏈 RFC 激活 DNA聚合酶和 RFC的 ATPase活性 PCNA 單鏈 DNA結(jié)合蛋白，激活 DNA聚合酶，使解旋酶容易結(jié)合 DNA RPA 功 能 蛋白質(zhì) 真核 DNA復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的功能 (二 )真核 DNA復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的類型和功能與原核基本相似 目 錄 DNA聚合酶 ?（ Pol ?）分子含有 4個(gè)亞基： 1. DNA聚合酶 ?/引發(fā)酶復(fù)合物合成 RNADNA引物 ? p180：催化亞基 ? p48：具有引發(fā)酶活性 ? p58： p48的穩(wěn)定性和活性所必需的 ? p70：與組裝引發(fā)體有關(guān) 目 錄 功能： 合成 RNA引物 反應(yīng)過程 ： 調(diào)節(jié)： 磷酸化的調(diào)節(jié)作用 Pol ?/引發(fā)酶復(fù)合物 首先，合成 RNA引物； 其次，利用 DNA聚合酶活性將引物延伸，產(chǎn)生起始DNA（ initiator DNA， iDNA）短序列，形成RNADNA引物； 最后， Pol ?/引發(fā)酶脫離模板鏈 DNA，發(fā)生 DNA聚合酶轉(zhuǎn)換（ switch）。 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 Ⅱ 的功能 目 錄 的 TopoⅣ 功能是將復(fù)制產(chǎn)生的兩個(gè)子染色體從連環(huán)體中分離出來，催化連環(huán)和去連環(huán)過程 。 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶功能： 目 錄 TopoⅠ 只作用于負(fù)超螺旋 DNA，消除負(fù)超螺旋 。 ?維持 、噬菌體和質(zhì)粒 DNA復(fù)制起始模板DNA負(fù)超螺旋狀態(tài)。它們可共價(jià)結(jié)合 DNA分子上的磷酸基團(tuán)， 切斷磷酸二酯鍵 。 目 錄 ?在復(fù)制過程中， DNA每復(fù)制 10bp，復(fù)制叉前方的模板 DNA雙螺旋就要繞其長軸旋轉(zhuǎn)一周，產(chǎn)生 正超螺旋 。 ?oriC的 GATC被完全甲基化 ， DnaA蛋白就能與之結(jié)合 ， 開始新的一輪復(fù)制 。 (四 ) Tus蛋白識別復(fù)制終點(diǎn)使復(fù)制終止 在復(fù)制叉匯合點(diǎn)兩側(cè)約 100kb處各有一個(gè)終止區(qū) （ ter D/A和 ter C/B） 。 ?復(fù)合物由 6種亞基組成： ?、 ?、 ??、 ?、 ?、 ? 目 錄 在復(fù)制叉同時(shí)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈 目 錄 3? 5? 3? 5? 前導(dǎo)鏈 (leading strand) 后隨鏈 (lagging strand) 解鏈方向 岡崎片段 目 錄 目 錄 ?5??3?外切酶： 去除 RNA引物 ?3??5?外切酶： 起校正作用 ?DNA聚合酶活性： 填補(bǔ)兩個(gè)岡崎片段之間的缺口 DNA聚合酶 Ⅰ 有 3個(gè)酶促活性結(jié)構(gòu)域 : 目 錄 323個(gè)氨基酸 小片段 5? ? ??核酸外切酶活性 大片段： Klenow 片段 604個(gè)氨基酸 DNA聚合酶活性 ?? ? 5? 核酸外切酶活性 N 端 C 端 枯草桿菌蛋白酶 DNApol Ⅰ 目 錄 Tus蛋白具有 反解旋酶 （ contrahelicase）活性 ， 識別并結(jié)合 ter序列中共有序列 ， 阻止Dna B蛋白的解旋作用 ， 從而 抑制復(fù)制叉前進(jìn) 。 DNA聚合酶 Ⅲ DNA聚合酶 Ⅱ 目 錄 TLS 1 Rev 1 TLS，體細(xì)胞高變 1 Pol ? 相對準(zhǔn)確的 TLS（穿越環(huán)丁烷二聚體） 1 Pol ? TLS 1 Pol ? 體細(xì)胞高變（ somatic hypermutation） 1 Pol ? 減數(shù)分裂相關(guān)的 DNA損傷修復(fù) 1 Pol ? TLS 1 Pol ? DNA交聯(lián)損傷修復(fù) 1 Pol ? DNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù) 4 Pol ? DNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù) 2~3 Pol ? 線粒體 DNA復(fù)制和損傷修復(fù) 3 Pol ? 堿基切除修復(fù) 1 Pol ? 合成引物 4 Pol ? 功 能 亞基數(shù)目 真核生物 TLS（ translesion synthesis） 3 Pol Ⅴ (UmuC, UmuD) DNA損傷修復(fù)，穿越損傷合成（ TLS） 1 Pol Ⅳ (Din B) 染色體 DNA復(fù)制 9 Pol Ⅲ 全酶 染色體 DNA復(fù)制 3 Pol Ⅲ 核心酶 DNA損傷修復(fù) 1 Pol Ⅱ 去除 RNA引物， DNA損傷修復(fù) 1 Pol Ⅰ 功 能 亞基數(shù)目 原核生物（ ） 原核、真核細(xì)胞 DNA聚合酶的類型和功能 目 錄目 錄 ?２個(gè)核心酶 ?1個(gè) ?復(fù)合物（ ?、 ?、??、 ?、 ?、 ? 6種亞基） ?可滑動(dòng)的 DNA夾子（含 1對 ?亞基） DNA聚合酶 Ⅲ 全酶結(jié)構(gòu) 全酶結(jié)構(gòu)包括： 目 錄 ?亞基 （ 130 000）主要功能是合成 DNA ?亞基 具有 3??5?外切酶活性（校正功能）?亞