【正文】 的強弱來判斷樣本中相應的抗體和 /或抗原的存在。若該診斷試劑沒有國家 — 9— 標準品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。 每一批酶聯(lián)免疫類檢測試劑的試生產(chǎn)量應滿足工藝研究、分析性能驗證、穩(wěn)定性研究、臨 床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。抽樣數(shù)量應包括檢驗用數(shù)量和留樣數(shù)量。試劑盒各組分應留樣， 2 8℃定期作穩(wěn)定性考核，同時作 37℃熱穩(wěn)定性試驗，試驗結(jié)果應符合產(chǎn)品的質(zhì)量標準。對定量檢測試劑，同時應分析其線 性相關(guān)系數(shù)和定量質(zhì)控品檢測結(jié)果的準確性。 檢驗指標一般包括陰 /陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應達到相應的質(zhì)量標準要求。半成品檢驗，一般使用國家標準品（參考品）或經(jīng)國家標準品（參考品）標化后的企業(yè)參考品。 （四）質(zhì)量控制 （ 1）半成品抽樣 檢驗人員按試劑的批號，根據(jù)抽樣申請單抽取規(guī)定數(shù)量的半成品各 — 8— 組分，作號標記、待檢。 分裝及包裝均應按照相應的標準操作規(guī)程要求進行。 應對包被過程進行相應的質(zhì)量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質(zhì)量檢驗、包被液和封閉液的質(zhì)控（如配方、外觀、 pH 值）、包被過程的監(jiān)控（包括包被和封閉的體積、溫度、時間等）、包被均一性檢驗、干燥過程的監(jiān)控等。不同批號的板條不能混用。 包被前應對酶標反應板進行質(zhì)量檢驗，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標反應板的批號、數(shù)量、標識。對于定量檢測試劑，其標準品（或校準品）溶液應具有量值溯源性。若陰性、陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時應在相應的生物安全實驗室完成。 （三）試劑盒各組分的生產(chǎn) 酶聯(lián)免疫法檢測試劑主要組分的生產(chǎn)包括酶標記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標反應板、分裝及包裝等步驟；并通過產(chǎn)品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質(zhì)控過程來保證其質(zhì)量符合規(guī)定。如該產(chǎn)品具有國家標準品或參考品，應使用國家標準品（參考品）進行標化；若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則企業(yè)參考品的制備應有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安 全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。 （ 3）其他材料 包括試劑瓶標簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密 封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應參照國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》和《醫(yī)療器械說明書、標簽和包裝標識管理規(guī)定》建立相應質(zhì)量控制標準。 CV 值結(jié)果應符合相關(guān)產(chǎn)品的功能性質(zhì)量標準，一般批內(nèi) CV≤ 5％，批間 CV≤ 10％。②吸附能力和精密性采用合適的方法進行檢驗?；瘜W原材料在購入時，原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學原材料的質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗報告。 3.化學原材料 化學原材料的質(zhì)量標準，包括外觀、一般鹽類檢測、溶液 pH 值 、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等，均應符合《中國生物制品主要原輔材 — 5— 料質(zhì)控標準（ 2021 年版）》分析純級別的要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。 對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進行功能性實驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進行酶聯(lián)免疫測定，均不能出現(xiàn)非特異性反應。（ 3）酪蛋白： 應符合生產(chǎn)所需的質(zhì)量標準。 總蛋白中的牛血清白蛋白（ BSA）含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標準為≥ 95%。 溶解性：將牛血清白蛋白配成 10%溶液，在 18 26℃時，溶解時間應≤ 15 分鐘， pH值應為 。 球蛋白含量：取待測血清 1ml，采用飽和硫酸銨法進行沉淀，沉淀溶于 %氯化鈉溶液，至 1ml，用 Lowry 方法測定，蛋白含量應≤2mg/ml。無菌試驗：將血清直接 37℃放臵 7 天，明亮處觀察，不得出現(xiàn)混濁或 — 4— 沉淀。這些生物原料的質(zhì)量標準應符合 2021年版的《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準》規(guī)定的 標準要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。 （ 5）功能性實驗 功能性實驗是指生物原料用于試劑盒實際生產(chǎn)中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等，并比較其與上批次原料的相關(guān)性。 （ 4）效價 效價的測定一般根據(jù)蛋白含量測定結(jié)果，通過倍比稀釋法進行。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應達到相應的質(zhì)量標準，分子量大小應在正確的條帶位臵。 （ 2）純度和分子量 主要經(jīng) SDSPAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn)，其工藝必須相對穩(wěn)定；若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據(jù)國家相關(guān)法規(guī)的要求進行變更申請。這類原料可用于包被酶標反應板、標記相關(guān)酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應用抗原或抗體、制備校準品（標準品）等。 ：保證試劑使用安全、質(zhì)量穩(wěn)定、工藝可控、檢測有效。 、規(guī)范的原則，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學原理。 — 2— 術(shù)人員、儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》；同時，應按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實施細則（試行）》的要求建立相應的質(zhì)量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行；還應通過《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。其他酶聯(lián)免疫法檢測試劑（如作為二類管理的體外診斷試劑）可參考本指導原則執(zhí)行。 本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善、科學技術(shù)的不斷發(fā)展，其相關(guān)內(nèi)容也將進行適時的調(diào)整。 本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如 果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。 第二篇：酶聯(lián)免疫法檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則 附件 1 酶聯(lián)免疫法檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則 一、前言 本指導原則主要針對酶聯(lián)免疫類檢測試劑的主要原材料、生產(chǎn)工藝及反應體系、產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)提出指導性技術(shù)要求。后經(jīng)專家和企業(yè)反復討論后刪除了這一要求，原因有以下幾點：第一，該類試劑已有多個同類產(chǎn)品在國內(nèi)外批準上市，按照法規(guī)要求，可選擇已上市同類試劑，驗證該類試劑的檢測準確性； 第二，該類試劑的臨床特異性受臨床試驗受試人群的年齡、性別以及區(qū)域的影響較大，而且目前并無大量流行病學的調(diào)查數(shù)據(jù)支持 75%的聲稱，因此，臨床特異性無法給出具體要求。鑒于臨床實踐和研究證明，肺癌患者是一類與γ 干擾素相關(guān)的癌癥，因此，規(guī)定了肺癌患者的最低樣本例數(shù)，以考察該類試劑的特異性。申報試劑應選擇疑似結(jié)核患者進行檢測，以模擬臨床實際使用情況。 同時，指導原則也明確，如果申請人對該類試劑的預期用途設(shè)定為結(jié)核分枝桿菌感染的 檢測，需提供足夠的臨床證據(jù)支持該聲稱。但是，因為潛伏感染的診斷在全世界均無金標準，而且中國人出生就接種卡介苗，導致對潛伏感染預期用途的臨床驗證目前缺乏有效的對比方法，因此，目前申請人申報該類試劑的預期用途基本用于結(jié)核病的輔助診斷。因此，對于該類試劑，不管是采用何種方法，交叉反應的研究都是采用血漿或其他基質(zhì)檢測細胞因子對γ 干擾素抗體對的交 叉反應性。因此，此類試劑的交叉反應性，主要考慮全血自身含有的細胞因子或全血刺激培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的細胞因子與申報試劑所用γ 干擾素抗體對是否存在交叉反應。 采用 ELISA 方法的試劑，精密度不僅需要考察全血培養(yǎng)階段的精密度，而且需要考察 ELISA 檢測部分對干擾素含量檢測的精密度，前者可參考 ELISPOT 方法的相關(guān)要求和方法，后者參考常見 ELISA 方法檢測試劑的要求和方法。在討論日間精密度時，企業(yè)和相關(guān)專家均提出，因 為全血樣本無法凍存，無法在不同的自然天內(nèi)進行日間精密度的研究。指導原則建議，申請人可根據(jù)自己的研發(fā)平臺，設(shè)置科學合理的方法，進行最低檢測限的試驗。因此，參考美國 FDA 已批準同類試劑的要求，經(jīng)討論后，對 ELISPOT 方法學的此類試劑，無需進行最低檢測限的驗證。而 ELISA 方法是在全血培養(yǎng)后，吸出血漿上清，檢測上清中的干擾素的含量，因此，采用該方法學的此類試劑需要設(shè)置培養(yǎng)階段和干擾素 ELISA 檢測階段參考品，包括：陰性參考品、陽性參考品、線性參考品、最低檢測限參考品和精密度參考品等。 針對企業(yè)參考品的組成，由于 ELISPOT方法是在全血細胞培養(yǎng)后，直接在固體基質(zhì)表面形成斑點，計數(shù)斑點判斷結(jié)果，理論上 可計數(shù)一個斑點。 二、重點問題的說明（一）企業(yè)參考品的組成和樣本類型目前，該類試劑采用全血樣本作為檢測樣本類型，所涉及的方法學包括：ELISPOT和 ELISA。 《結(jié)核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則》編制說明一、編制背景結(jié)核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑是指利用免疫學檢測技術(shù)，如 ELISA 或 ELISPOT 技術(shù)等，以結(jié)核分枝桿菌特異抗原刺激 T 細胞產(chǎn)生的γ 干擾素為檢測靶標，對人靜脈全血中的結(jié)核分枝桿菌特異性細胞免疫反應進行體外檢測的試劑，可用 于結(jié)核分枝桿菌感染的檢測或用于結(jié)核病的輔助診斷。 對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。 分析特異性 交叉反應：明確可能產(chǎn)生交叉反應的其他細胞因子的驗證情況。 企業(yè)陰陽性參考品的檢測符合情況：簡單介紹陰陽性參考品的組成和符合率結(jié)果等信息。 有關(guān)假陽性結(jié)果的可能性分析，如：與其他分枝桿菌是否存在交叉反應。 8.【檢驗方法的局限性】 ，對患者的臨床診治應結(jié)合其癥狀 /體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。重點關(guān)注以下問題：對于采用 ELISPOT 方法的申報試劑，明確培養(yǎng)時所用外周血單個核細胞的數(shù)量以及所用培養(yǎng)基類型。 對于采用 ELISA 方法的申報試劑，應明確：全血樣本在與抗原孵育培養(yǎng)前的保存溫度與時間。 5.【樣本要求】重點明確以下內(nèi)容： 樣本的采集：明確所用抗凝劑。 試劑盒技術(shù)原理的詳細介紹，建議結(jié)合適當圖示進行說明。 申報試劑的注冊單元不應包含真空采血管，真空采血管應按相應法規(guī)申報注冊。 2.【主要組成成分】 說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。 說明與預期用途相關(guān)的臨床適應癥背景情況，說明相關(guān)的臨床或?qū)嶒炇以\斷方法。結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對結(jié)核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進行說明。 （十）產(chǎn)品說明書產(chǎn)品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告 2021 年第 17 號）的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應盡量保持與原文說明書一致，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。對于采用 ELISPOT 方法的申報試劑，產(chǎn)品技術(shù)要求的性能指標至少應包括：外觀、陰性參考品符合率、陽性參考品符合率和精密度。內(nèi)容主要包含產(chǎn)品性能指標和檢驗方法，并在附錄中明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定要求。 ，申請人應按照法規(guī)要求，設(shè)置合理的對比方法，選擇合適的預期適用人群，進行臨床試驗。 試驗方案中應確定嚴格的樣本入選 /排除標準，任何已經(jīng)入 選的樣本再被排除出臨床試驗都應記錄在案并明確說明原因。 ，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。 申報試劑對涂片陰性的肺結(jié)核患者和肺外結(jié)核患者均應有一定的檢出率 。 對臨床試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計應選擇合適的統(tǒng)計方法，如受試者工作特征（ ROC）曲線分析、陰性 /陽性符合率等。 臨床報告中應明確：總樣本例數(shù)； 臨床診斷為肺結(jié)核患者的總例數(shù)，說明涂片陰性和涂片陽性的肺結(jié)核患者例數(shù)； 肺外結(jié)核患者的例數(shù)，說明各類肺外結(jié)核患者的例數(shù)； 非結(jié)核的其他呼吸道疾病患者以及易混淆疾病樣本例數(shù)，并詳細說明各類非 結(jié)核疾病的患者例數(shù)。 全血樣本不能凍融，臨床試驗應采用新鮮樣本，樣本采集和保存等應滿足申報試劑和對比試劑說明書的相關(guān)要求。 ，申請人可選擇境內(nèi)已批準上市、臨床普遍認為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對比試劑，采用試驗用體外診斷試劑（以下稱申報試劑）與對比試劑進行比較研究試驗，證明本品與已上市產(chǎn)品等效。 （七）臨床試驗臨床試驗總體要求及臨床試驗資料的內(nèi)容應符合《辦法》、 44 號公告和《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告 2021 年第 16 號）的規(guī)定，以下僅結(jié)合結(jié)核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑的具體特點對其臨床試驗中