【正文】 2020422 五、加熱沉淀法 依據(jù)：蛋白質(zhì)的熱變。 ? ： ? 有機溶劑能 降低溶液的介電常數(shù) ，使溶質(zhì) 分子 間 因引力而凝集 ；或 破壞水膜 (降低水活度 )而溶解度降低；或 破壞 pro副鍵 ，改變其空間結(jié)構(gòu)而使疏水基團暴露而析出。 ? (1)鹽種類：影響 KS， KS越大，效果越好 ? (2)鹽析劑用量 ? (3) 溫度和 pH：影響 β 值而影響 S。 2020422 ? 蛋白膠體穩(wěn)定的原因是蛋白質(zhì)顆粒周圍水化膜和電荷的存在。 2020422 三、 鹽析沉淀法 ： ? (1)鹽溶： [鹽 ]低時， S隨 [鹽 ]增加而增加； ? (2)鹽析： [鹽 ]高時， S隨 [鹽 ]增加而降低； 2020422 溶解度與鹽濃度的關(guān)系可用下式表示： logS=β － KS ? 通過加酸或堿調(diào) pH＝ pI， pro分子的凈電荷為零，分子聚集在一起。 ? 加酸、堿、鹽、有機溶劑、其它物質(zhì)。 2020422 7 沉淀法 一、沉淀法概述 : ? 利用物質(zhì)能和某些酸、堿或鹽形成不溶性或復(fù)合物沉淀或結(jié)晶。 ? 常用作生物大分子的濃縮和脫鹽。 ? 基本要求：吸收劑與溶液不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。鹽類及發(fā)酵產(chǎn)品不進入冰內(nèi)而留在液相中。 2020422 薄膜蒸發(fā)濃縮 ? 薄層流動，短時受熱，高效傳熱。⑤ 腐蝕性 )不同而不同 （ 2）要求 ? 傳熱強度大，汽液分離好，設(shè)備適應(yīng)物料性質(zhì)。③ 易結(jié)垢或析出晶體 。 2020422 影響蒸發(fā)濃縮的因素 ? 溫度：高，動能大； ? 面積：大，汽化的分子數(shù)多、蒸速快； ? 溶劑蒸汽壓：越大，越慢； 2020422 蒸發(fā)濃縮的工業(yè)分類 常壓： 環(huán)管、橫管豎、夾套、外循環(huán)、強制循環(huán)、薄膜 真空： 單效、多效 2020422 蒸發(fā)濃縮過程的選擇和要求 （ 1）選擇 ? 蒸發(fā)方法因被蒸發(fā)溶液的性質(zhì) (① 熱敏性 。受熱越多，獲得的動能也越大，分子逃離的可能性越大。 ? 用于：有機酸、氨基酸、核苷酸、酶制劑等的發(fā)酵液及提取液 2020422 一、蒸發(fā)濃縮 ? 將溶液加熱到沸騰，溶劑蒸發(fā)，溶質(zhì)留下 機理： ? 某一溫度下，溶液具有一定的飽和蒸汽壓，當(dāng)液面溶劑蒸汽分子密度很小時，溶劑分子就會不斷地汽化逸出空間，以維持這一飽和蒸汽壓。 2020422 G－ 25分離氨基酸混合物圖 2020422 九 .凝膠層析常見問題 1．流速慢 （ 1）有氣泡、出水管阻塞 （ 2）沒打開夾子 （ 3）柱壓太緊（操作壓過大、長期使用、接頭漏氣） 2020422 2．柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡 （ 1）上水口不流或皮管破裂，洗脫液外流 （ 2）接口漏氣，如上水口螺絲擰的不緊 3．條帶扭曲 （ 1）膠面不平 （ 2）樣品或洗脫液中有顆粒 （ 3）裝柱不均勻 2020422 4．分辯率不高 （ 1）裝柱不均勻 （ 2）樣品量過大 （ 3）流速太快 （ 4）柱不垂直或不合適 （ 5）長菌 （ 6）拄下口軟管太長 （ 7）膠不適當(dāng) 2020422 6 濃縮 ? 去除溶劑，將低濃度 →→ 高濃度。 2020422 ? 現(xiàn)象 : 多次使用，凝膠顆粒可能逐漸沉積壓緊，流速變慢 ?處理方法： 將凝膠自柱內(nèi)倒出重新填裝 反沖法，使凝膠松散沖起，然后自然沉降，形成新的柱床 2020422 凝膠用過后，有幾種保存方法： ?濕態(tài)保存：在水相中加防腐劑，或水洗到中性，高壓滅菌封存（或低溫存放）； ?半收縮保存：水洗濾干，加 70％乙醇使膠收縮，再浸泡于70％乙醇中保存； ?干燥保存：水洗濾干，依次用 50％、 70％、 90％、 95％乙醇脫水，再用乙醚洗去乙醇，干燥 (或 60～ 80℃ 烘干）后保存。 (2)酸、堿再生 (輕度 )。 – ③不會使凝膠色澤變化。 、直徑 ? 柱長 :直徑 =10:1或 7:1 V0 ? 對于裝填良好的柱 V0/Vi=4060% 2020422 六 .防止微生物污染的方法 防止污染的辦法： ? 加抑菌劑 ? 加防腐劑 工業(yè)用防腐劑要求： – ①不與凝膠發(fā)生作用。 也就是說 ， 流速較低 ， 分辨率較高 ， 樣品稀釋較輕 。 2020422 較快的流速下得到的冼脫峰寬 。 ? 保持洗脫速度恒定通常有兩種方法，一種是使用恒流泵，另一種是恒壓重力洗脫。 2. 粒度 ? 粒度的大小影響顆粒間間隙的大小，從而影響分離效果。 ? (5)保存須防腐。 ? (3)裝柱后要洗滌。 2020422 操作注意 : ? (1)凝膠的選擇要恰當(dāng) (據(jù)發(fā)酵醪、產(chǎn)物性質(zhì)而定 )。 ? 洗脫液：主要取決于待分離樣品，一般來說只要能溶解被洗脫物質(zhì)并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析。否則將造成色譜帶擴散、紊亂，嚴(yán)重影響分離效果。 （ 3）加葡萄糖 2020，使終濃度為 1%. 2020422 ? 樣品與柱床體積比例懸殊時分離效果好，但過少的樣品量不但會造成設(shè)備和器材的浪費，降低工作效率，還會造成樣品稀釋。s（ 帕斯卡秒 ） ? 對蛋白質(zhì)類樣品濃度以不大于 4％ 為宜 ? 如果樣品渾濁 ， 應(yīng)先過濾或離心除去顆粒后上柱 ? 分析用量一般為每 100mL床體積加樣品 1～ 2mL ? 制備用量一般為每 100 mL床體積加樣品 20～ 30 mL 2020422 （ 1）加葡萄糖 2020，使終濃度為 5%，相對粘度 。也可以對光檢查，看其是否均勻或有無氣泡存在。 2020422 ?新柱裝好后，要用洗脫緩沖液平衡，一般用 3～ 5倍體積的緩沖液在恒壓下流過柱床。 ? 柱裝得不好往往造成洗脫區(qū)帶加寬 ， 甚至使一些本來可以分開的區(qū)帶重疊 。 ? 干粉形式保存使用前用水或洗脫緩沖液充分溶脹：將干膠往水里加 ， 邊加邊攪 ， 以防凝膠結(jié)塊 ， 然后放到沸水浴中加熱接近 100℃ ， 幾個小時就可以使其溶脹 ， 還可起到除去顆粒內(nèi)部氣泡和殺菌作用 。 對于在水中保存的凝膠如瓊脂粉凝膠顆粒直徑應(yīng)在 150μm 左右 。 在同一流速下不同粒度的 Sephadex G25柱的洗脫效果。 2020422 ? 細粒凝膠柱流速低，但洗脫峰窄，分辨率高，多用于精制分離或分析等。 ? 選擇適宜的凝膠是取得良好分離效果的最根本的保證。層析柱的直徑和長度比一般在 1： 25～ 1：100之間。一般來講，主要是層析柱的長度對分辨率影響較大，長的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱過長會引起柱子不均一、流速過慢等困難。 2020422 交聯(lián)葡聚糖凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu) 2020422 G類葡聚糖凝膠常用 GX代表， X數(shù)字既代表交聯(lián)度，也代表特水量： ?X數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，吸水膨脹就越小。 2020422 （ 3）交聯(lián)葡聚糖凝膠（ Sephadex) ?葡聚糖凝膠（ Sephadex）具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，是目前生化產(chǎn)品制備中最常用的凝膠。 各種類型均以英文字母 P和阿拉伯?dāng)?shù)字表示 ， 從 BioGel P2至 BioGe1 P300。 ?不耐酸： pH211 2020422 聚丙烯酰胺凝膠的結(jié)構(gòu) 2020422 ?商品聚丙烯酰胺為顆粒狀干粉，有成塊粘附傾向，在溶劑中自動溶脹成膠。 2020422 （ 2）聚丙烯酰胺（ BioGel P) ? 人工合成凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。前面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分?jǐn)?shù)， F代表粉末狀， C代表顆粒狀。阿拉伯?dāng)?shù)字乘以 106表示排阻限度。阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分含量。一般懸浮在 l03 mo1/L EDTA和 %疊氮化鈉溶液中。故實際上 Ve小分子 ＝ Vo＋ ； Kd = （ VeVo） /Vi 2020422 三 、常用凝膠 : ? 由于膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì) ,其內(nèi)部具有很微細的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) .層析法中常用凝膠有 : ? : ? (1)馬鈴薯淀粉凝膠 ? (2)瓊脂和瓊脂糖凝膠 ? : ? (1)聚丙烯酰胺凝膠 ? (2)交聯(lián)的葡萄糖凝膠 2020422 （ 1）瓊脂糖凝膠 （ agarose gel） ?由瓊脂中分離出來的天然凝膠，依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。 ?Kd＝ 0時， Ve=Vo，說明這種溶質(zhì)被排阻于凝膠顆粒之外而最先洗脫下來； ?Kd＝ 1時，即 Ve小分子 ＝ Vo＋ KdVi，說明這種溶質(zhì)完全向凝膠顆粒內(nèi)擴散，在洗脫過程中將最后流出柱外。 Kd可通過實驗由 Ve、 Vo和 Vi求得。 Wr求得 （ g為干凝膠質(zhì)量 ， 單位為 g，Wr為凝膠吸水量 ， 以 mL／ g表示 ） 。 可以用一個已知相對分子質(zhì)量遠超過凝膠排阻極限的有色分子 ， 如常用的藍色葡聚糖 2020溶液通過柱床 ， 即可測出柱床的外水體積 Vo。 ? 大分子：分布于凝膠顆粒的間隙，以較快的速度流過層析柱； ? 小分子：能不斷地進出于一個又一個的顆粒微孔的內(nèi)外； ? 組分：分子按由大到小的順序先后而分離。 ? 洗脫中分離 ? 可濃縮 2020422 7 反相層析 (reverse phase chromatography) 利用固相載體上偶聯(lián)的疏水性較強的配基，在一定非極性的溶劑中能夠與溶劑中的疏水分子發(fā)生作用，以非極性配基為固定相，極性溶劑為流動相來分離不同極性的物質(zhì)的方法，稱之為反相層析。 2020422 5 疏水層析 (hydrophobic chromatography) 固相偶聯(lián)的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進行分離的方法。被分離物質(zhì)在兩相中由于分配系數(shù)的差異而分離。 2020422 2 離子交換層析（ IEC） ? 原理：離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動相中溶質(zhì)靜電引力差異來進行分離的一種方法。 2020422 按兩相所處狀態(tài)分類 流動相 液體 氣體 液體 液 液層析法 氣 液層析法 固定相 固體 液 固層析法 氣 固層析法 2020422 按層析原理分類 名稱 分離原理 吸附層析法 組份在吸附劑表面吸附固定相是固體吸附劑，各能力不同 分配層析法 各組份在流動相和靜止液相（固相）中的分配系數(shù)不同 離子交換層析法 固定相是離子交換劑，各組份與離子交換劑親和力不同 凝膠層析法 固定相是多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同 親和層析法 固定相只能與一種待分離組份專一結(jié)合，以此和無親和力的其它組份分離 2020422 按操作形式不同分類 名稱 操作形式 柱層析法 固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿著一個方向前移而達分離 薄層層析法 將適當(dāng)粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點樣后用流動相展開，使各組份分離 紙層析法 用濾紙作液體的載體，點樣后用流動相展開，使各組份分離 薄膜層析法 將適當(dāng)?shù)母叻肿佑袡C吸附劑制成薄膜，以類似紙層析方法進行物質(zhì)的分離 2020422 二 層析機理 1 排阻層析 (exclusion chromatography) 利用凝膠層析介質(zhì) (固定相 )交聯(lián)度的不同所形成的網(wǎng)狀孔徑的大小，在層析時能阻止比網(wǎng)孔直徑大的生物大分子通過。 2020422 2 離換膜電滲析制備無機鹽水 離換膜電滲析制備無機鹽水 ＋＋＋＋＋＋－－－－－－1C?1C?1C?1C?1C?1C?Na?Na?Na?Na?Na?Na?1 2 3 4 5 陽 膜 陰 膜 陽 膜 陰 膜陰 極陽 極濃 縮 室 淡 化 室 濃 縮 室圖 1 3 － 3 9 電 滲 析 過 程 原 理 示 意 圖2020422 ? 電滲析器及其脫鹽流程設(shè)計