【正文】 這些觀察的臨床意義提出了一點就是兩種藥物劑量的減少的可能性。另一個處于我們的觀察的結(jié)果是MVDN30和METTKIs之間的協(xié)同作用。這并不奇怪，因為這兩種類型的抗性細胞都是嗜MET細胞，因此，依賴MET的信號減少導(dǎo)致了它們的死亡。因此，可以想象，為了防止由于癌基因過量用藥而產(chǎn)生抗性，間斷性用藥的機制可能會比連續(xù)用藥更有效。有趣的是，他還表明不連續(xù)的藥物劑量，運用耐藥細胞在沒有藥物環(huán)境下的劣勢來防止耐藥性的發(fā)作。事實上，在抗體缺乏，低劑量的遇到了TKI治療耐藥細胞（抑制野生型細胞活力）增加了他們的活力，減少了信號的水平細胞持續(xù)強度的可能。我們的結(jié)果和報告是一致的都表明了，正常細胞和腫瘤細胞不僅對信號（即該通路被激活的信號）的質(zhì)量敏感而且對數(shù)量也很敏感（這種量就是怎樣激活通路）?？剐约毎匀灰蕾囉贛EI的信號傳導(dǎo)來增殖和生存，MET可以完全被TKIR抑制從而導(dǎo)致它們的增殖受到抑制。在缺氧的環(huán)境下觀察A549細胞中MET呈3倍增加才能滿足它的生化效應(yīng)，在抗MVDN30的EBC1細胞中MET增加可以解釋為什么抗體能夠有效地下調(diào)MET。EBC1 原代細胞的METcDNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以達到一個和抗性細胞一樣是表達水平，證明了事實上細胞表達更多的MET可以減少對MVDN30抑制活性的敏感性。MET上調(diào)的增加是由于MET基因擴增造成的這種現(xiàn)象并不明顯當(dāng)抗性細胞培養(yǎng)在有抗體（這種抗體介導(dǎo)了MET的下調(diào)）存在的條件下，但是在沒有這種抗體存在的條件卻是很明顯清晰的。在我們的研究中表明,在嗜MET細胞中對MET特定抗體MVDN30的抗性獲得是由于MET復(fù)制數(shù)量的大量增加。臨床證據(jù)表明癌細胞是沉溺在原癌基因中的細胞，在這種細胞中的MET具有組織性活性并且它們的抑制結(jié)果就是使其致瘤性被破壞。然而，在人類癌癥中變化頻繁的是轉(zhuǎn)錄表達的過程，這個過程是由原癌基因激活誘導(dǎo)抑癌基因失活和對特定的為mRNA或缺氧刺激的下調(diào)過程。生殖細胞的激活突變的識別和遺傳型腎乳頭狀癌直接證明了MET和人類腫瘤發(fā)生有關(guān)的概念。在癌癥治療中MET受體已經(jīng)變成了最具關(guān)注的目標，因為很多研究表明，MET在多種人類腫瘤中具有組成性活性。在EGER中的二次突變表明了免疫調(diào)節(jié)藥物與EGFR的結(jié)合受到破壞從而調(diào)節(jié)了抵抗力。從癌細胞和抗酪氨酸激酶抑制劑表明，獲得性耐藥的最常見的機制包括在藥物目標本身的二次突變的患者獲得的數(shù)據(jù)，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或平行的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活突變。圖5臨床效應(yīng)甚至是最有效的靶向治療都被發(fā)展的耐藥性所限制。當(dāng)在GTL16 WT 胃癌細胞上做這個實驗室會得到相似的結(jié)果（圖5D）。然后我們分析細胞活力和對藥物治療的兩種藥物的組合效應(yīng)的性質(zhì)，利用多藥效果分析。圖4 TKIs的協(xié)同作用METTKIs 和 MVDN30 都可以有效的抑制EBC1細胞的活性，我們想知道這兩種抗MET化合物是否表現(xiàn)增強或協(xié)同作用。事實上，如圖4E所示，保存在不含MVDN30并用 10 nM JNJ38877605（低于IC50濃度）處理的抗性細胞可以恢復(fù)它們的活性，并且這種水平類似于保存在有抗體存在的培養(yǎng)條件下的抗性細胞的活性水平。這些數(shù)據(jù)進一步表明，p38 。然而，24~48h后，after 24e48 h, p38 MAPK的活化清晰可見證明了通常在細胞凋亡反應(yīng)之前會有一個細胞應(yīng)激反應(yīng)。抗性細胞培養(yǎng)在不存在MVDN30的條件下，顯示了活性下降（圖4C）。和親代EBC1細胞相比，抗性細胞對JNJ38877605的敏感劑量更低，可能是由于在抗性細胞中MET的蛋白合成和轉(zhuǎn)運更高效。圖3為了證明抗MVDN30的細胞也是嗜MET細胞，我們用一種小分子的激酶抑制劑JNJ38877605來處理細胞。除此，盡管有MVDN30的存在MET保持磷酸化，這就解釋了為什么細胞能夠存活增加（圖3E）。為了證明這種增加可能是為了維持對MVDN30的抗性，我們將EBC1WT細胞放在不同量的MET cDNA條件下轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過比較EBC1R20和R80細胞mRNA的表達水平來獲得（圖3）。如圖3所示，EBC1抗性細胞顯示了MET的大量復(fù)制（原代細胞的第24代到30代），這大約是二倍體細胞的15倍。在EBC1WT和抗性細胞的熒光素酶檢測結(jié)果顯示排除這些可能性（數(shù)據(jù)未顯示）。如上圖所示（圖2BeD），MVDN30抗性細胞表達MET水平比原代細胞更高。(F)在遞增MVDN30濃度的環(huán)境下的EBC1(左圖)和R20細胞（右圖）的活性檢測。質(zhì)膜著色如圖E。(B)在有或沒有（24小時去除）的EBC1WTR20和R80細胞中的蛋白（頂部）和蛋氨酸的酪氨酸磷酸化蛋白印跡。(E)結(jié)合MET的在24小時在不存在或存在的血漿膜的熒光強度的箱圖mvdn30 R20和R80生長EBC1 WT細胞（AU：任意單位）圖2—細胞耐受性并不是由于失去了對MVDN30的敏感性。 (***P )。(C)在MVDN30(20 and 80 mg/ml)存在的條件下生長的EBC1 WT細胞EBC1R20和R80細胞的生長活性。與未經(jīng)過處理的WT細胞(100%)177。 。(A)在有MVDN30的遞增濃度的條件下培養(yǎng)了72小時的EBC1 WT細胞的細胞活力?？傊械慕Y(jié)果表明EBC1細胞的抗性不是因為MVDN30活性缺乏，而是由于用它的飽和能力來促進了一種高效的MET解離。最后，用更高劑量抗體20 mg/ml(R20)處理EBC1細胞來更好的證明MVDN30在抗性細胞中是具有活性的。對抗性細胞再引入MVDN30細胞會導(dǎo)致上清液中MET ECD含量更高，與在同樣劑量處理的WT細胞相比，之后細胞內(nèi)的MET同時減少了并返回到平時觀察的抗性細胞的一半水平（圖2 D）。在相同劑量MVDN30存在的條件下培養(yǎng)了24小時的抗性細胞和WT細胞的上清液中，抗性細胞上清液中含有更豐富的脫落的ECD（圖2A）。我們想知道在抗性細胞里的抗體受損是否是由于MET的結(jié)構(gòu)域IPT4發(fā)生突變引起，這個結(jié)構(gòu)域是它的集合位點，但是我們沒有發(fā)現(xiàn)任何突變（數(shù)據(jù)顯示）。除此，盡管激活的下游目標AKT和MAPK激酶都被保存在有抗體存在的條件下（圖1D）。如圖1D所示，事實上，MVDN30的治療導(dǎo)致了再EBC1細胞中的MET通過酪氨酸酶的磷酸化消除大量減少。正如前面提到的，MVDN30發(fā)揮它的抑制活性是通過誘導(dǎo)MET的結(jié)構(gòu)域蛋白反正溶蛋白裂解，隨后又通過蛋白酶體受體介導(dǎo)受體降解。, 進一步的實驗中，我們使用耐20細胞（ebc1 R20）和80（ebc1 R80）毫克/毫升mvdn30，劑量是分別是前面的約10倍和40倍，然后測這些細胞的抗體IC50（圖1a）。我們先前培養(yǎng)的EBC1細胞 對不同的YKIs有抗性表明了這種抗性可能是由于MET基因的進一步擴增。EBC1 肺癌細胞是MET沉癮細胞，它能放大MET的擴增、過度表達和活化過程。CI值 1表明兩種藥物之間的協(xié)同作用。評估細胞活力為前面描述的增效作用的藥物效應(yīng)多種分析研究，采用組合指數(shù)（CI）和Chou and Talalay 方法。在抗MET抗體MVDN30和MET TKI JNJ38877605之間進行藥物協(xié)同作用分析是對WT EBC1和接種在96孔板上的GTL16細胞在用藥物治療72小時后的細胞活力的研究。轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的可行性分析如先前描述的一樣進行，讓細胞在存在或不存在MVDN30的條件下上長72小時。MVDN30抗性細胞(R20 and R80)只用空載體感染。)的p24病毒抗原，其濃度按說明確定。254。254。質(zhì)膜結(jié)合的蛋氨酸的熒光強度（AU為單位），通過使用GraphPad Prism軟件繪制為箱形繪圖圖表。然后在室溫下細胞又在PBS中用2%FBS洗滌就會逐步產(chǎn)生抗鼠IgGRPE二抗然后用二脒基苯基吲哚作用20分鐘。熒光性的強度可以通過細胞熒光性分析檢測到。所有的數(shù)據(jù)進行歸一化到0天的藥物治療。用于細胞生長和可行性分析的這些細胞被接種在96孔的培養(yǎng)板上，根據(jù)制造商的說明用已知藥物在不同時期進行處理然后用細胞滴度發(fā)光細胞進行可行性分析。細胞裂解液和上清液都在有已知抗體的培養(yǎng)基里培養(yǎng)16個小時，抗鼠IgG抗體預(yù)包被瓊脂糖凝膠蛋白珠形成免疫復(fù)合物沉淀下來。在這之后，去處放射性標記的培養(yǎng)基，細胞用1ml磷酸鹽緩沖液鹽水洗兩次然后保存在有2mlISCOVE的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入2%FBS，在MVDN30(80 mg/ml)。R80 細胞保存在有或沒有抗體（80 mg/ml）存在的條件下，而WT細胞要一直保存在有抗體的條件小16小時。免疫印跡法使用了以下的初級抗體：the antiMET Intracellular domain(ICD)(zymed, 370100)from Invitrogen, antiMET ECD(DL21)obtained as described(Prat et al., 1991), antiphosphoTyr1234Tyr 1235MET(3126), antiAKT(9272), antiphosphoSer473AKT(4060),antip44/42MAPK(9102),antiphosphoThr202Tyr204p44/42MAPK9101),antip38MAPK(8690),antiphosphoThr180Tyr182p38 MAPK(9215), from CellSignaling。蛋白提取液(40 mg), 細胞上清液(20 ml)。hACTIN Rw: ，這種技術(shù)是用 TaqMan基因表達的主要結(jié)構(gòu)和TaqMan探針MET基因和RNaseP控制基因的實時定量PCR分析。hMET ex 20 Rw: 50GGGCTCCTCTTGTCATCAGC3。We 我們利用下面的小分子：ATP競爭行MET TKIs PHA665752(Tocris Bioscience)and JNJ38877605(Johnson amp。EBC1 and GTL16 細胞對MET TKIs PHA665752(EBC1 RPHA 50 nM and GTL16 RPHA 150 nM)都有耐受性，并且向描述的那樣培養(yǎng)可以一直保持PHA665752的存在。所有的抗體耐受細胞培養(yǎng)在存在MVDN30并且可以使它們產(chǎn)生耐受性的條件下。D 提供的通過暴露親代細胞方法來增加抗MET單價單克隆抗體的濃度。HEK293T細胞系分離于人類胚胎時期的腎，A549細胞系來源于肺癌，都是從ATCC購買來培養(yǎng)的。 EBC1 細胞從一個患有轉(zhuǎn)移皮膚腫瘤的病人取得，這個患者還患有肺鱗狀細胞癌，病例是從日本癌癥資料庫購買得到。有趣的是，它們獲得了藥物耐受性，當(dāng)受到MVDN30的驅(qū)除致死它們的是過多的信號表達。在這個研究中我們表明了不斷用MVDN30來治療沉癮癌細胞會使其具有抗性的原因是MET基因的大量復(fù)制和MET的過度表達超過了MVDN30對其有效下調(diào)并使其失去活性的的能力。這促進了MET介導(dǎo)的生物活性的抑制作用。它的誘導(dǎo)、再結(jié)合、達到MET脫落閾值的能力使其有抑制活性，剩余的跨膜片段通過蛋白酶體降解途徑處理掉。然而，關(guān)于對MET的單克隆抗體的再次具有抗性一無所知。在活體和動物模型進行的研究已經(jīng)表明用TKIs長期治療會導(dǎo)致機體的治療耐受性。除此之外，還表明細胞顯示大量復(fù)制（超過8張）和隨之而來的過度表達和獨立配體的激活都是沉溺于這種致癌基因和抗MET藥物的應(yīng)答中。在腫瘤組織中，浸潤性生長的增進可以迫使腫瘤細胞從腫瘤組織中分解下來侵蝕基底膜，滲入基質(zhì)中，甚至定居于新的組織中來實現(xiàn)轉(zhuǎn)移。最近，一種作為癌癥治療目標的RTK受到關(guān)注，這種RTK是由致癌基因編碼的在肝細胞生長因子上的酪氨酸激酶受體。在癌癥治療中的可以抗癌的RTKs單克隆抗體已經(jīng)被批準在乳腺癌和結(jié)腸癌中使用(分別針對HER2和表皮生長因子受體)并可作為抗血管增生的藥物（針對血管內(nèi)皮生長因子受體）。單克隆抗體已被廣泛用于臨床并取得了可觀的成果。酪氨酸激酶抑制劑是一種可以抑制靶蛋白酶活性的小分子物質(zhì)。Gschwind等人，2004）。癌基因和人類癌癥密切相關(guān)，酪氨酸激酶起著決定性作用。盡管靶向治療在一部分癌癥患者中取得了較優(yōu)異的效果，還有重要的一點就是部分癌癥病人對藥物的選擇表達沒有起到治療作用（原發(fā)性），除此之外，幾乎總是一開始患者反應(yīng)變成后來對治療的抵抗和復(fù)發(fā)（繼發(fā)性）。這就意味著單個基因的抑制或死亡是由于它們的沉癮，或者至少抑制它們的生長（溫斯坦,2002）。與主要殺死擴散細胞為主的傳統(tǒng)化療不同的是靶向藥物對腫瘤細胞采取一種更具體的治療方式。結(jié)果表明一種不連續(xù)的通過抗體和化學(xué)激酶抑制劑聯(lián)合治療可能會使靶向治療的臨床反應(yīng)和對MET抗體治療旁路的抗性增加。除此之外，抗體抗性細胞還具有藥物依賴性,MVDN30的去處導(dǎo)致它們死亡是由于它們的過度信號表達。這種過度表達可以使單克隆抗體的“脫落”活動達到飽和，并且能夠防止表面的MET受體的有效的下調(diào)和抑制劑的活化作用。EBC1型肺癌細胞是MET基因擴增的結(jié)果，并且這種細胞對MET抑制劑非常敏感，包括MET單克隆抗體的單機形式在內(nèi)。Comment: 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