xxxx-9-16bt第2講基因工程第1講-概論(參考版)
2025-02-28 15:23本頁面
【正文】 67 重組體的轉(zhuǎn)化 受體細(xì)胞 轉(zhuǎn)移： 含氨芐平板 重組質(zhì)粒 感受態(tài) 重組體 68 含氨芐平板 連接 目的基因 基因載體 連接酶 轉(zhuǎn)化 重組體克隆的篩選與鑒定 篩選： 宿主細(xì)胞 69 外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá) 重組子 目的基因的 mRNA 表達(dá)蛋白質(zhì) 大腸桿菌 （ ） 工程細(xì)胞 表達(dá)： 目的基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測 70 重組 DNA操作一般步驟 ： （ 1） 分 離 ：提取和獲得目的基因 和載體 DNA； （ 2） 切 割 ：分別對目的基因和載體 DNA 酶切 ； （ 3） 連 接 ：目的基因與載體連接， 形成新的重組 DNA分子； （ 4） 轉(zhuǎn) 化 ：用重組 DNA分子轉(zhuǎn)化受體 細(xì)胞； （ 5） 篩 選 ：能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺 傳；對轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定 ； （ 6） 表 達(dá)： 對獲得外源基因的細(xì)胞或生 物體通過培養(yǎng)，獲得所需的 遺傳性狀或表達(dá)出所需要的 產(chǎn)物。 （ 2） 篩 選：利用核酸雜交，酶切分析、 PCR和表型特征等技術(shù)，篩選出已克隆化的工程菌 /細(xì)胞。 本階段的操作也有三個主要環(huán)節(jié)。 為目的基因提供在受體細(xì)胞中的 表達(dá) 能力。 63 分離： 目的基因的獲取 需要克隆的 DNA片段： 化學(xué)合成法 cDNA文庫 基因組 DNA文庫 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 64 載體 DNA的選擇 功能 ： 為目的基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的 轉(zhuǎn)移 能力。 （ 2） 切 割：選擇合適的 RE工具酶，分別對外源目的 DNA分子和載體 DNA分子進(jìn)行酶解切割。 62 1．分子水平操作階段： 獲得含目的基因的重組體分子（亦稱重組子）。 基因產(chǎn)品有效益、開始新興產(chǎn)業(yè)。 59 ? 1982年 把大白鼠的生長激素基因克隆、轉(zhuǎn)移到小鼠的受精卵內(nèi)， 第一個轉(zhuǎn)基因超級鼠誕生。人生長激素抑素基因被重組到大腸桿菌的質(zhì)粒 DNA中 。 生物工程從此進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化。 把小鼠的生長激素抑素基因在大腸桿菌中表達(dá)。這是第一次成功的基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)。 標(biāo)志著基因工程的誕生。 分別把編碼卡那霉素和四環(huán)素抗性基因的兩種質(zhì)粒酶切、連接，再將這種重組的 DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌，某些轉(zhuǎn)化菌落具有既抗卡那霉素又抗四環(huán)素的雙重抗體特性。 基因工程的大膽嘗試 51 基因工程的誕生 1980年 Nobel化學(xué)獎 1972年斯坦福大學(xué)的 Paul Berg小組完成了首次體外重組實(shí)驗(yàn)。 1972年， Boyer等在發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶 EcoR I 的基礎(chǔ)上，開始了實(shí)驗(yàn)。 49 1970年， MIT 的科學(xué)家率先提出在體外把不同來源的遺傳物質(zhì)進(jìn)行重組的設(shè)想，但遭到反對，不予支持。 基礎(chǔ)方面的基本條件（ 可能性 +可行性 + 可操作性 ）具備，尚需人的科學(xué) 創(chuàng)新思維 + 艱苦的實(shí)踐 。 而后發(fā)現(xiàn)經(jīng)過改造的質(zhì)粒、噬菌體和病毒都可以攜帶目的 DNA片段和基因，經(jīng)過轉(zhuǎn)化大腸桿菌，建立該基因的無性繁殖系。必須將其安全轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞才能進(jìn)行增殖，賦予其“生命”。 最早發(fā)現(xiàn)的是：質(zhì)粒、噬菌體和病毒。必須連到具有復(fù)制能力的 DNA分子上。 （復(fù)印機(jī)） ? 構(gòu)成了一個研究 DNA、 RNA分子的 工具酶箱 。 （手術(shù)刀剪） ? 同年 Khorana又發(fā)現(xiàn)了 T4DNA連接酶（ Ligase）， 能將 DNA片段連接在一起。 41 二、分子遺傳學(xué)新方法是基因工程的 技術(shù)基礎(chǔ) （ 六大技術(shù) ） ? 首當(dāng)其沖的是要解決： ① 如何自如地得到目的基因； ② 如何在體外改造基因，得到重組體； ③ 如何在體外轉(zhuǎn)移重組基因； ? 直到 20世紀(jì) 70年代中期，相繼出現(xiàn)了 幾項(xiàng)關(guān)鍵性技術(shù)，夢想成真。 40
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