基因工程的基本技術(shù)(參考版)
2024-09-22 21:09本頁面
【正文】 提示： 轉(zhuǎn)基因時，目的基因是通過 TDNA的整合作用把TDNA的左右邊界和其中間的 目的基因 和 選擇標記基因 一起整合進受體細胞基因組中。 Ct值與起始模板的關(guān)系 Threshold line C(t) value C(t) value +/ 閾值線 Ct值 Ct值 熒光信號如何產(chǎn)生？ SYBR Green 1 Molecular Beacons TaqMan 熒光化學試劑 思考題 1 ? 假設通過基因槍轟擊技術(shù)，獲得一株具有 抗旱目的性狀 的轉(zhuǎn)基因水稻，但此轉(zhuǎn)基因水稻出現(xiàn)了 株高 比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账咀儼姆前行誀?。利用已知起始拷貝?shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代 Ct值。 C代表 Cycle， t代表 threshold Ct值的含義是： 每個反應管內(nèi)的熒光信號 開始由 本底進入指數(shù)增長階段時 到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如后圖所示） PCR反應的前 15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是 315個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的 10倍，即： threshold = 10 180。 概念： 原理：通過 實時檢測 PCR每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物相對應的熒光信號， 來實現(xiàn)對 起始模板 進行定量及定性的分析。 已知序列 未知序列 未知序列 酶切 酶切 引物 2 引物 1 此 PCR操作過程： 酶切基因組 DNA 連接環(huán)化目的 DNA 用引物 1和引物 2組合擴增出側(cè)翼序列 ?（ 4） 定量 PCR 用途： 分析基因組中某個基因的拷貝數(shù)或分析基因的轉(zhuǎn)錄表達豐度。 ? （ 2） RTPCR： 是一類以 mRNA為最初模板的基因的擴增。 反應體系配置： 167。 (6)、 PCR反應程序設定： (1)、變性溫度和時間 ： 要求變性徹底，但要考慮酶的半衰期： ℃ （ 2小時） 95℃ （ 40min） 97℃ （ 5min） 94℃ 變性比較徹底，酶的半衰期也不短。 (4)、 引物濃度： ，過多則非特異擴增增加，形成 引物二聚體 ； 167。 (3)、 模板：主要考慮 純度及使用量 對純度要求不高，但含有酚、氯仿等雜質(zhì)則難以成功。 (1)、 Taq酶：常用 1U/25181。mol/L，不能低于 20181。 167。 La Taq酶 4）、反應緩沖液成分： 167。 常規(guī)酶 167。 基因組 DNA、質(zhì)粒 DNA、其它 DNA片段； 167。 使用濃度： ，高達 1uM； 167。 1）、引物（寡聚核苷酸） 167。 技術(shù) 3： PCR技術(shù) (polymerase chain reaction) ? PCR反應過程： 變性： DNA雙鏈變?yōu)閱捂湥? 退火：引物與模板結(jié)合； 延伸：合成互補鏈； 上述過程通過 PCR儀的程序設計及自動運作完成。 ? 電泳 指示劑 ? DNA染色劑 ? 熒光染色劑 ,溴化已錠： （ EB, Ethidium bromid） 吸收 300~360nm UV（紫外光） 放出 590nm可見光（橙紅色） ? 硝酸銀：常用 % ? Goldview染料 吸收紫外光，放出綠光（雙鏈 DNA）或橙紅色光（單鏈 DNA） （三）凝膠電泳過程 制膠：稱取一定量的瓊脂糖用電泳緩沖液融解后倒入制膠槽配制； 放膠：膠
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