基因工程-7章pcr技術(shù)及其應(yīng)用(參考版)
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【正文】 2022/9/20 95 3．凝膠電泳中出現(xiàn)引物二聚體區(qū)帶 ①檢查引物的 3’端是否互補(bǔ)； ②設(shè)計(jì)較長(zhǎng)的引物； ③增加靶目標(biāo) DNA的量； ④降低引物濃度； ⑤減少周期次數(shù)； ③增加退火溫度； 4． PCR產(chǎn)物特異性不夠 ①增加退火溫度； ②減少退火時(shí)間及延伸時(shí)間； ③降低引物和 Taq DNA聚合酶的濃度 ④改變 Mg2+濃度。 如果用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR產(chǎn)物，應(yīng)該用多大濃度的瓊脂糖凝膠比較合適？ 如果沒有得到 PCR產(chǎn)物，可能存在哪些問題，如何解決？ 如果 PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)呈現(xiàn)片狀，可能存在哪些問題，如何解決？ 如果 PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，其特異性不夠，可能存在哪些問題，如何解決？ 在進(jìn)行 PCR時(shí)，遇到一些問題時(shí)的解決辦法： 1．沒有得到所希望的 PCR產(chǎn)物 ①確證是否加入酶，檢查酶是否有活性； ② DNA解鏈?zhǔn)欠癯浞郑? ③人工合成的引物是否正確； ④在未加 Taq DNA聚合酶以前，將反應(yīng)系統(tǒng)在 95℃ 保溫 5～10分鐘，使蛋白酶及核酸酶失活。 H u m a n H M G B 1 P 0 9 4 2 9 M o u s e H M G B 1 P 6 3 1 5 8 C h i c k H M G B 1 Q 9 P U K 9 F r o g H M G B 1 Q 7 S Z 4 2 H u m a n H M G B 2 P 2 6 5 8 3 M o u s e H M G B 2 P 3 0 6 8 1 C h i c k H M G B 2 P 2 6 5 8 4 F r o g H M G B 2 Q 3 2 N S 7 H u m a n H M G B 3 O 1 5 3 4 7 M o u s e H M G B 3 O 5 4 8 7 9 C h i c k H M G B 3 P 4 0 6 1 8 F r o g H M G B 3 O 5 4 8 7 9 L j H M G B 1 H Q 6 1 5 9 9 1 A m p h i H M G 1 / 2 Q 6 P U E 4 S e a u r c h i n H M G 1 P 4 0 6 4 4物種進(jìn)化圖 2022/9/20 94 要求將下面基因片段克隆至表達(dá)載體 pET28a相應(yīng)位點(diǎn)上，并獲得此基因的表達(dá)。 AATG 7 repeats 8 repeats AATG AATG 引物 引物 引物 引物 簡(jiǎn)單序列重復(fù) (SSR)實(shí)驗(yàn)方法 現(xiàn)場(chǎng) 嫌疑人 1 嫌疑人 2 嫌疑人 3 法醫(yī)鑒定 案例一 母親 兒子 男性 1 男性 2 男性 3 親子鑒定 案例二 4. 考古學(xué)中生物種類間的親緣關(guān)系、進(jìn)化途徑判定 5. 基因動(dòng)、植物的檢測(cè) ⑴轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測(cè)：檢測(cè)某一基因的遺傳穩(wěn)定性。 ⑶ 惡性腫瘤的診斷 。 2. 醫(yī)學(xué) ⑴ 感染性疾病病原體的診斷： HIV、 結(jié)核桿菌、乙肝病毒等。 2022/9/20 83 L y mp h o c y t e Intes t ine Kid n e y He a r t Gill020406080Relative ExpressionTi ss ues C o n t ro l Lps C o n A實(shí)時(shí)定量 PCR法檢測(cè) LjHMGB2基因在各組織中含量 2022/9/20 85 三、 PCR技術(shù)應(yīng)用 1. 基礎(chǔ)研究 ⑴ 基因或 cDNA 克隆：從基因數(shù)據(jù)庫中獲得某一基因或 cDNA 核苷酸序列 , 用 PCR 方法擴(kuò)增并克隆該基因或 cDNA。 ? 模板每復(fù)制一次，就有一個(gè)探針被切斷，伴隨一個(gè)熒光信號(hào)的釋放。發(fā)射基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)發(fā)生分離，抑制作用被解除， 518nm處的光密度增加而被熒光探測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到。 ? 探針的 5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán) (熒光發(fā)射峰值在518nm處 )， 3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán) (熒光發(fā)射峰值在 582nm處 )且被磷酸化，以防止探針 3’端在 PCR擴(kuò)增過程中被延伸。 2022/9/20 80 2022/9/20 81 ? 工作原理是 利用 Taq酶的 5’→3’ 外切酶活性。這對(duì)科研是很有利的，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。 Green I與雙鏈 DNA結(jié)合發(fā)出熒光，通過檢測(cè) PCR反應(yīng)液中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，可以對(duì)目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量，同時(shí)還可以測(cè)定擴(kuò)增的目的 DNA片段的融解溫度。 以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì) PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)?PCR過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而達(dá)到評(píng)估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量 PCR。 2022/9/20 68 3’Full RACE 5’Full RACE 5’ flanking region of chicken ovalbumin gene 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(realtime PCR): ?美國 PE（ Perkin Elmer）公司 1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。 用途： 制備核酸序列測(cè)定的模板 制備雜交探針 基因組 DNA結(jié)構(gòu)功能的研究 2022/9/20 67 高濃度引物 低濃度引物 嵌套 PCR(或稱巢式 PCR) ?是指先后用兩套引物進(jìn)行擴(kuò)增的 PCR。 方法：采用兩種不同濃度的引物。用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。 可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析 ,如探索鄰接已知 DNA片段的序列；用于僅知部
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