westernblot配方和方法(參考版)
2024-08-27 23:55本頁(yè)面
【正文】 。3. 手上的油脂會(huì)影響蛋白的轉(zhuǎn)移，操作時(shí)應(yīng)戴手套。 注意事項(xiàng)：1. 最常見的問題是背景信號(hào)過高。1曝光：（曝光的整個(gè)過程需要避光）將兩種發(fā)光劑按1:1的比例混合（一般一張膜用100ul混合液），體積根據(jù)膜的大小以及多少來定。膜蛋白面朝下放于抗體液面上，室溫?fù)u床孵育1h～2h。孵育二抗：用5%脫脂奶粉TBST按適當(dāng)比例（一般小鼠5000:1，兔2000:1）稀釋二抗。搖床搖半小時(shí)后，放在濕盒中4℃過夜。裁下一塊封口膜，折成小船鋪于濕盒中，將脫脂奶粉加到小船中，用移液槍把一抗注進(jìn)奶粉溶液里，搖床上搖一會(huì)。1洗膜：TBST洗膜一次。封閉：5%脫脂奶粉配制：TBST 40ml +脫脂奶粉2g。 將膜晾干備用。如果由于時(shí)間原因來不及做下面實(shí)驗(yàn)，可以在4度下12V轉(zhuǎn)膜過夜）（，不容易轉(zhuǎn)膜過頭）（，轉(zhuǎn)移效率是不一樣的，所以換用轉(zhuǎn)膜裝置，最好再摸個(gè)條件）（） 考馬斯亮藍(lán)染膠（一般不需要做這步）轉(zhuǎn)完后將膜用1麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。（，對(duì)于小分子量的蛋白，轉(zhuǎn)膜時(shí)最好墊兩塊PVDF膜，以免轉(zhuǎn)膜過頭，因?yàn)槿绻谝粡埬ど系鞍踪|(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)過了，第二張膜上還有蛋白質(zhì)可以進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)于分子量大的蛋白，轉(zhuǎn)膜時(shí)間要長(zhǎng)一點(diǎn)，開始最好也用兩塊膜，特別是務(wù)必注意加強(qiáng)降溫措施。轉(zhuǎn)膜時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通）（最后做成的“三明治”千萬不能形成短路，不然有可能會(huì)短路燒壞轉(zhuǎn)膜裝置）。最后蓋上另一個(gè)纖維墊，搟幾下就可合起夾子。將裁好的PVDF膜置于甲醇中浸一下才可使用。如果樣本多，同時(shí)做幾張膜，可用鉛筆在膜下角標(biāo)ABCD或1234，這樣可以分出膜的正反和加樣順序。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起再墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。在上面墊一張纖維墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。在加有轉(zhuǎn)膜液的盤里放入轉(zhuǎn)膜
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