【正文】 拼一個(gè)春夏秋冬！贏一個(gè)無(wú)悔人生！早安！—————獻(xiàn)給所有努力的人.。不奮斗就是每天都很容易，可一年一年越來越難。是狼就要練好牙，是羊就要練好腿。以下為需要說明的其它問題：合作單位１ (公章)合作單位２ (公章)合作單位３ (公章)2. 申請(qǐng)者所在單位領(lǐng)導(dǎo)的審查意見與保證 已對(duì)申請(qǐng)書內(nèi)容進(jìn)行了審核,申請(qǐng)書填報(bào)內(nèi)容屬實(shí)并保證在項(xiàng)目獲得資助后做到以下幾點(diǎn): (１)保證對(duì)研究計(jì)劃實(shí)施所需的人力、物力和工作時(shí)間等條件給予支持； (２)嚴(yán)格遵守廣東省自然科學(xué)基金管理委員會(huì)有關(guān)資助項(xiàng)目管理和財(cái)務(wù)管理的各項(xiàng)規(guī)定； (３)督促項(xiàng)目負(fù)責(zé)人和本單位科研管理部門按廣東省自然科學(xué)基金管理委員會(huì)的規(guī)定及時(shí)報(bào)送有關(guān)報(bào)表和材料。如果獲得資助，我與本項(xiàng)目組成員將嚴(yán)格遵守廣東省自然科學(xué) 基金委員會(huì)的有關(guān)規(guī)定，切實(shí)保證研究工作時(shí)間，按計(jì)劃認(rèn)真開展研究工作，按時(shí)報(bào)送有關(guān)材料。前一個(gè)廣東省基金項(xiàng)目的完成為本研究在實(shí)驗(yàn)技術(shù)、理論和基金管理上提供了良好的基礎(chǔ)。 與本申請(qǐng)項(xiàng)目關(guān)系： 本研究針對(duì)我國(guó)尤其是廣東地區(qū)日益嚴(yán)重的社會(huì)問題——吸毒，進(jìn)行機(jī)理的揭示性研究，并為該領(lǐng)域的臨床治療提供新的理論和方法。達(dá)到目標(biāo)： 通過本項(xiàng)研究，確立TNF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞骨架的影響，查明p38 MPAK在TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架重構(gòu)的作用。總資助金額為5萬(wàn)元，已完成主要成果：(1) 確定TNF對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架的重構(gòu)作用。另附該已結(jié)題項(xiàng)目已發(fā)表主要相關(guān)論文首頁(yè)復(fù)印件(限三篇)。因此，本項(xiàng)目所需的圖書資料有充足的保證。南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物所為華南地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，提供有關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保障。申請(qǐng)者目前所在的廣東省功能蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室關(guān)于MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究工作有較好的工作基礎(chǔ)。 超聲粉碎系統(tǒng)(Colparmer) DNA序列分析系統(tǒng)(DNA Star) 顯微攝象系統(tǒng) 紅細(xì)胞跟蹤相關(guān)儀1臺(tái)(IPM,USA) 熒光顯微鏡(Olympus) 真空泵 高溫高壓自動(dòng)滅菌器(Sanyo) 細(xì)胞內(nèi)顯微注射系統(tǒng)(Narishige) 70低溫冰箱(NUAIRE) 酶標(biāo)儀(Dynatech) ACTA FPLC蛋白純化系統(tǒng)(Phamacia) J25立式高速低溫離心機(jī)(Beckman) 高速離心機(jī)(Beckman) 倒置顯微鏡(Olympus) 多功能電泳系統(tǒng)(Phamacia) PCR儀 (PE9600和Minicycler)（5）應(yīng)用免疫光鏡、電鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)p38激酶不同亞型(a、b、g、d)在細(xì)胞中的定位。（3）應(yīng)用Western blot、激酶活性測(cè)定等檢測(cè)LPS誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞p38激酶激活的量效與時(shí)相變化。發(fā)現(xiàn)p38蛋白激酶激活是熱損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所必需的。該工作已發(fā)表在J Neurochemistry，2002, 82:14531464研究工作基礎(chǔ)之二： 。相關(guān)工作總結(jié)已發(fā)表在（3）運(yùn)用D1和D3多巴胺受體基因敲除小鼠模型系統(tǒng)地探討了可卡因作用下細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路、基因表達(dá)的變化。主要研究工作包括：（1）世界上首次構(gòu)建并鑒定了cfos基因細(xì)胞特異性(D1多巴胺受體神經(jīng)元)的基因敲除小鼠（2）運(yùn)用cfos基因細(xì)胞特異性的基因敲除小鼠，系統(tǒng)地研究了可卡因作用下cfos基因?qū)P1家族網(wǎng)絡(luò)，小鼠行為學(xué)、電生理學(xué)、晚期反應(yīng)基因、神經(jīng)元形態(tài)學(xué)等功能的影響。 本項(xiàng)研究的開展和完成，將進(jìn)一步在分子水平上闡明阿片類毒品成癮的發(fā)生機(jī)制，為該領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供新的理論和方法，為臨床開發(fā)戒毒新藥提供新的思路。 查明D1與D3多巴胺受體對(duì)長(zhǎng)期嗎啡作用下的晚期反應(yīng)基因的調(diào)控。 查明多巴胺受體在嗎啡誘導(dǎo)的MAPK激活中的作用（反向調(diào)控或協(xié)同調(diào)控）。Western blot 鑒定 免疫組織化學(xué)鑒定 Neuroadaptation3. 年度研究計(jì)劃及預(yù)期進(jìn)展全部實(shí)驗(yàn)分兩年完成：2006年1月2007年12月 嗎啡對(duì)MAPK信號(hào)通路的激活作用研究及D1與D3多巴胺受體對(duì)嗎啡作用下的早期反應(yīng)基因的調(diào)控作用（反向調(diào)控或協(xié)同調(diào)控） 1．MAPK激酶活性測(cè)定(野生型、D1與D3多巴胺受體基因敲除小鼠) ERK激酶活性測(cè)定 JNK激酶活性測(cè)定 P38激酶活性測(cè)定 2．D1類和D2類多巴胺受體激動(dòng)劑對(duì)MAPK的激活 3．cfos誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè) 4．CREB磷酸化活性檢測(cè) 5．MAPK抑制劑對(duì)cfos和CREB表達(dá)的影響 D1與D3多巴胺受體對(duì)鴉片類作用下的晚期反應(yīng)基因的調(diào)控。 223。D1類和D2類多巴胺受體激動(dòng)劑對(duì)MAPK的激活 早期反應(yīng)基因： CREB, or cfos cfos誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)CREB磷酸化活性檢測(cè)MAPK抑制劑對(duì)cfos和CREB表達(dá)的影響 223。220。D1多巴胺受體基因敲除模型 D1 receptor / D2 receptor D3多巴胺受體基因敲除模型 （—） 223。該慢性刺激模型可以導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)明顯的依賴、耐受和截?cái)喟Y狀。Microarray的出現(xiàn)和迅速發(fā)展為研究基因表達(dá)模式提供了一個(gè)有力的工具。取野生型、D1基因敲除和D3基因敲除小鼠(每組4只)，分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：(1)D1類多巴胺受體激動(dòng)劑SKF81297腹腔注射，分離Cpu檢測(cè)ERK活性(2)D2 類多巴胺受體激動(dòng)劑PD128907，腹腔注射，分離Cpu檢測(cè)ERK活性(3)D1+D2 類多巴胺受體激動(dòng)劑SKF81297+PD128907，聯(lián)合腹腔注射，分離Cpu檢測(cè)ERK磷酸化活性2．進(jìn)一步，我們擬應(yīng)用D1和D3多巴胺受體基因突變模型研究急性嗎啡在D1和D3基因突變模型中對(duì)MAPK不同亞型激活的時(shí)間曲線(1). ERK的磷酸化活性曲線： (2). JNK的磷酸化活性曲線： (3). P38的磷酸化活性曲線：（四）D1與D3多巴胺受體對(duì)阿片類作用下的早期反應(yīng)基因的調(diào)控作用；1．急性嗎啡在野生型(wildtype, WT)，D1和D3基因突變(D1, D3 knockout, ko)模型中對(duì)早期反應(yīng)基因cfos 和creb誘導(dǎo)表達(dá)的檢測(cè)(每組5只小鼠)(1). cFos基因誘導(dǎo)表達(dá)：、a. Western blot： b. 免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry):(2). CREB的磷酸化活性a. CREB的磷酸化活性時(shí)間曲線： b. 比較CREB在不同基因型中的激活：2．MAPK 通路對(duì)早期反應(yīng)基因作用的特異性研究應(yīng)用MAPK 通路的特異性抑制劑，觀察其對(duì)早期反應(yīng)基因的誘導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控作用，即多巴胺受體介導(dǎo)的早期反應(yīng)基因的變化，是否通過MAPK通路傳導(dǎo)。（三）D1與D3多巴胺受體在嗎啡誘導(dǎo)的MAPK激活中的作用研究1．D1類受體和D2類受體激動(dòng)劑對(duì)MAPK的激活作用我們先前的研究表明，在D1類和D2類多巴胺受體激動(dòng)劑的聯(lián)合作用下， D3多巴胺受體的基因敲除可以導(dǎo)致小鼠自主活動(dòng)增強(qiáng)，而單純的D1類或D2類多巴胺受體激動(dòng)劑作用下，D3多巴胺受體基因敲除小鼠無(wú)自主活動(dòng)增強(qiáng)現(xiàn)象，這提示D3多巴胺受體通過抑制D1多巴胺受體功能而影響動(dòng)物的行為學(xué)。2．急性嗎啡刺激對(duì)MAPK不同亞型激活的時(shí)間曲線本研究擬首先觀察嗎啡對(duì)MAPK通路的激活狀況，即何種亞型被激活，激活特性如何，觀察以下指標(biāo)：(1). ERK的磷酸化活性曲線：a. PhosERK1/2活性測(cè)定： b. Western blot對(duì)ERK1/ERK2蛋白進(jìn)行定量： (2). JNK的磷酸化活性曲線：測(cè)定方法類似上述ERK, 一抗分別為phosJNK和 JNK。動(dòng)物房恒溫恒濕，12小時(shí)晝夜節(jié)律控制(8:0020:00)。 B D1與D3動(dòng)物模型由University of Cincinnati, Dr. Ming Xu 提供。D1基因敲除小鼠在可卡因作用下自主活動(dòng)明顯降低，而D3受體的基因敲除使小鼠自主活動(dòng)增強(qiáng)，呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。２. 擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析（一）D1與D3多巴胺受體基因敲除小鼠D1與D3多巴胺受體基因敲除小鼠模型的構(gòu)建與鑒定參見Xu M et al., 1994。 Zhang L et al., 2004(b)。 Zhang D et al., 2002。3．MAPK激酶活性測(cè)定及早期反應(yīng)基因的檢測(cè)。2．D1和D3多巴胺基因敲除小鼠的構(gòu)建與鑒定D1和D3多巴胺基因敲除小鼠的構(gòu)建與鑒定見Xu M et al., 1994,1997。 2．應(yīng)用D1與D3多巴胺受體基因敲除小鼠，探討多巴胺受體在嗎啡誘導(dǎo)的MAPK激活中的作用（反向調(diào)控或協(xié)同調(diào)控） 3．應(yīng)用D1與D3多巴胺受體基因敲除小鼠，探討D1與D3多巴胺受體對(duì)嗎啡作用下的早期反應(yīng)基因的調(diào)控作用； 4．應(yīng)用D1與D3多巴胺受體基因敲除小鼠，探討D1與D3多巴胺受體對(duì)長(zhǎng)期嗎啡作用下的晚期反應(yīng)基因的調(diào)控。24(13):33443354Zhang D, Zhang L, Tang Y, Lou D, Sharp FR, Zhang J and Xu expression changes induced by repeated cocaine administration through the dopamine D1 receptors. Neuropsycopharmacology. (in press)三、研究方案１. 研究目標(biāo)、研究?jī)?nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標(biāo)通過本研究，查明阿片類藥物作用下，不同亞型多巴胺受體 (D1和D3多巴胺受體)對(duì)細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路及早期反應(yīng)基因、晚期反應(yīng)基因表達(dá)的調(diào)控作用，從而從分子水平上闡明阿片成癮的發(fā)生機(jī)制，為該領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供新的理論和方法。 852:198207.Zhang D, Zhang L, Lou DW, Nakabeppu Y, Zhang J, Xu M. The dopamine D1 receptor is a critical mediator for cocaineinduced gene expression. J Neurochem, 2002。 79:945955.Xu M, Koeltzow TE, Santiago GT, Moratalla R, Cooper DC, Hu XT, White NM, Graybiel AM, White FJ, Tonegawa S. Dopamine D3 receptor mutant mice exhibit increased behavioral sensitivity to concurrent stimulation of D1 and D2 receptors. Neuron, 1997。 51:141153.Xu M, Moratalla R, Gold LH, Hiro N, Koob GF, Graybiel AM, Tonegawa S. Dopamine D1 receptor mutant mice are deficient in striatal expression of dynorphin and in dopaminemediated behavioral responses. Cell, 1994a。 318(1): 315.Valjent E, Corvol JC, Pages C, Besson MJ, Maldonado R, Caboche J (2000) Involvement of the extracellular signalregulated kinas