核酸的結(jié)構(gòu)與功能(參考版)
2025-08-04 15:03本頁面
【正文】 遺傳病的診斷 途徑有五個(gè) :① 基因突變位點(diǎn)的直接檢出② 篩查與遺傳病有關(guān)的點(diǎn)突變 ③ 遺傳多態(tài)性標(biāo)記連鎖分析間接診斷 ④ 利用 cmRNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 進(jìn)行分析或直接分析cmRNA. 孕婦的產(chǎn)前診斷 已成為遺傳病產(chǎn)前基因診斷的最常用技術(shù)，替代了傳統(tǒng)的依賴于以探針為基礎(chǔ)的Southernblotting及 RFLP（限制性酶切片段長度多態(tài)性分析 ） 五 DNA合成（合成探針、引物、基因） 化學(xué)合成 ——DNA合成儀 DNA固相合成（亞磷酸三酯法） ?5’OH用二對甲氧三苯甲基（ DMT）保護(hù)， ?堿基上氨基用苯甲酸保護(hù) ?3’OH用氨基磷酸化合物活化 ? P521 合成過程 ? 保護(hù) 5’OH、活化 3’OH、保護(hù)所有 NH2 。 ?ＤＮＡ重組： 重組ＰＣＲ由 PCR擴(kuò)增的兩個(gè) DNA片段通過重組合后再經(jīng)延伸而制備出新的DNA分子 .其基本原理為將突變堿基，插入或缺失片段，或一種物質(zhì)的幾個(gè)基因片段均設(shè)計(jì)在引物中，先分段對模板擴(kuò)增，除去多余的引物后，將產(chǎn)物混合，再用一對引物對其進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 .其產(chǎn)物將是一重組合的 PCR主要用于位點(diǎn)專一堿基置換， DNA片段的插入或缺失 DNA片段的連接 (如基因工程抗體 ). 基因的體外突變和定位分析： 采用隨意設(shè)計(jì)的引物 ， 在體外對基因進(jìn)行嵌合 、 缺失 、 點(diǎn)突變等改造 。 PCR的反應(yīng)原理 （四） PCR的主要用途 目的基因的克隆： ?PCR技術(shù)是迅速獲得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一 。 3． 延伸： 將反應(yīng)溫度提高到約 720C， 在耐熱 DNA聚合酶的催化下 ， 根據(jù)模板 DNA提供的堿基順序 ， 合成兩條互補(bǔ)鏈 ， 從而使模板 DNA擴(kuò)增一倍 。 1． 變性： 通常采用加熱變性 ， 即將模板DNA或延伸后的雙鏈 DNA加熱到 950C，使雙螺旋 DNA解開成為單鏈 。 5． 緩沖溶液 ：保證 DNA聚合酶催化時(shí)所需的適當(dāng)?shù)娜芤?pH值 。 3． 兩種引物： 為了保證 DNA聚合酶能夠?qū)蓷l互補(bǔ)鏈均能進(jìn)行延伸 ， 需要兩種引物 ，分別位于兩條互補(bǔ)模板 DNA鏈的 3`端 。 （二） PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成 ? PCR反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)包括： 1． 耐熱 DNA聚合酶 （ Taq酶 ） ：這是由耐熱細(xì)菌體內(nèi)提取的一種 DNA聚合酶 ， 可保證在 950C， 30分鐘以上不會變性失活 。 如此反復(fù)進(jìn)行 ， 在體外迅速將 DNA模板擴(kuò)增數(shù)百萬倍 。 四 PCR技術(shù) （ 一） PCR的概念 PCR(polymerase chain reaction)即 聚合酶鏈反應(yīng) ? 是體外酶促合成特異 DNA片段的新方法 ， 主要 是利用耐熱 DNA聚合酶的反復(fù)作用 ， 由 高溫變性 、低溫退火 和 適溫延伸 三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成： 即在高溫 （ 95℃ ） 下 ， 待擴(kuò)增的靶 DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈 DNA模板；而后在低溫（ 37～ 55℃ ） 情況下 ， 兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈 DNA模板結(jié)合 ， 形成部分雙鏈；在 Taq酶的最適溫度 （ 72℃ ） 下 ， 以引物 3’端為合成的起點(diǎn) ， 以單核苷酸為原料 ， 沿模板以 5’→ 3’方向延伸 ， 合成 DNA新鏈 。 ?終止法測定 DNA序列的原理 ?近年來 ， 通過采用不同的 熒光染料 標(biāo)記四種不同的雙脫氧核糖核苷酸 ， 其反應(yīng)混合物可在同一區(qū)帶上進(jìn)行電泳分離 ，然后用計(jì)算機(jī)進(jìn)行閱讀和分析 ， 可大大提高測序速度 ， 一個(gè)熟練的工作者一天可分析 1萬個(gè)核苷酸順序 。 5． 電泳分離： ?將四組含有長短不等的反應(yīng)混合物在同一聚丙烯酰胺凝膠板上進(jìn)行電泳 ， 即可將只相差一個(gè)核苷酸的寡核苷酸鏈分離開 。然后在適當(dāng)溫度條件下延伸互補(bǔ)鏈 ， 就可得到四組分別以 A、 G、 C、 T、 終止的長短不一的互補(bǔ)鏈的混合物 。 4． 互補(bǔ)鏈的延長和終止： ?將上述雜交混合液分為四份 ， 每份混合液中均加入 DNA聚合酶 ， 四種 dNTP， 一種帶 放射性同位素標(biāo)記的脫氧核糖核酸 （ 如 α 32PdATP） 。 3． 模板 引物雜交： ?將待測單鏈 DNA模板與寡核苷酸引物混合 ， 并在適當(dāng)溫度條件下進(jìn)行保溫處理 ，使引物與 DNA單鏈模板的 339。端的一段已知順序 ， 也可為一段 M13噬菌體的順序 。 2． 合成寡核苷酸引物： ?在待測 DNA片段的 339。 雙脫氧末端終止法的主要操作步驟 有： 1． 獲得待測 DNA片段的單鏈模板： ?一般采用基因工程的方法以獲取一定數(shù)量的單鏈待測 DNA模板 。遷移率與電壓大小成正比 RNA時(shí)需加 蛋白質(zhì)變性劑 如甲醛（避免 RNases的影響） ? DNA用 溴化乙錠 染色，在紫外光下呈 紅 橙色可見熒光 （二） PAGE電泳 ?孔徑較瓊脂糖小，用于分析相對分子﹤ 1000bp的 DNA和 RNA片段，一般不含RNase， RNA常用 亞甲藍(lán)或熒染 ?PAGE強(qiáng)度好，常用垂直板。 3. DNA的構(gòu)象：超螺旋最快，線形其次，開環(huán)形最慢。 （三） 核酸含量的測定 ： 鉬藍(lán)比色法：先用濃硫酸或過氯酸水解有機(jī)磷成無機(jī)磷，在酸性條件下正磷酸與鉬酸作用生成磷鉬酸，被還原劑還原成鉬藍(lán)，在660nm處有最大吸收峰 RNA與鹽酸共熱核糖轉(zhuǎn)變成糠醛，與甲基苯二酚反應(yīng)呈鮮綠色最大吸收峰 670nm DNA在酸性溶液中與二苯胺共熱，脫氧核糖參與反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，最大吸收峰 595nm 二 核酸凝膠電泳 ?（一） 瓊脂糖電泳 ：遷移率與分子量的對數(shù)成反比。 ?去蛋白：鹽酸胍、苯酚等。 ?DNP可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質(zhì)。 ?功能： 根據(jù)需要在特定的位點(diǎn)精確切割雙鏈 DNA分子 Section 7 核酸的研究方法 ?核酸分離純化 ? 核酸凝膠電泳 ? DNA序列分析 ? DNA合成（合成探針、引物、基因） 一 .核酸的分離、提純 要求 :防止核酸的降解和變性盡可能保持其天然態(tài)；條件溫和 ,防止過酸過堿 .避免劇烈攪拌 ,防止核酸酶作用?？梢蕴禺愋缘乃夂怂嶂心承┨囟▔A基順序部位。 ?核酸外切酶： 是從多聚核苷酸鏈的一端（ 3′ 端或 5′ 端）開始，逐個(gè)水解切除核苷酸； ?核酸內(nèi)切酶： 從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個(gè)位點(diǎn)切斷磷酸二酯鍵。這些酶可以催化水解多聚核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵稱為核酸酶 。在 RNA水解時(shí)， 2′ OH首先
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