【正文】 本研究的一部分是NSERC支持的。規(guī)定P 。統(tǒng)計(jì)分析除另有規(guī)定，本文中闡述的所有實(shí)驗(yàn)包含統(tǒng)計(jì)分析完全是獨(dú)立完成的，一式三份。內(nèi)化植物源性rhTf融合蛋白的檢測包含rhTf和抗糖尿病肽段胰高血糖素樣肽1(GLP1)(hTfGLP1) 或倍增的GLP1肽(10 GLP1串聯(lián)重復(fù)) (hTfGLP1x10)的植物源性rhTf融合蛋白，是植物額外產(chǎn)生的以測試植物源性rhTf作為一種新的載體系統(tǒng)　　以送遞治療藥物進(jìn)入特定細(xì)胞的潛在性能。收集上清液（含有細(xì)胞質(zhì)和核蛋白），其蛋白質(zhì)含量通過利用BioRad試劑盒和BSA作為標(biāo)準(zhǔn)的布拉德福法測定。隨后用裂解緩沖液裂解細(xì)胞[1% (v ? v) TritonX100, 50 mM Tris–HCl,150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10 mM NaF, 1 mM vanadate, 1 : 100(v ? v) phosphatase inhibitor cocktail, pH ]。通過將板子轉(zhuǎn)移到冰上使反應(yīng)停止，冷PBS清洗以清除多余的或?yàn)榻Y(jié)合的rhTf。然后將板子接種于無血清培養(yǎng)基SFF12中，37℃、1h，使細(xì)胞處于血清饑餓狀態(tài)。培養(yǎng)于新鮮10% (v?v)FBSRPMI 1640培養(yǎng)基中的Hela細(xì)胞()，接種到60x15毫米的皮氏培養(yǎng)皿中，37℃生長24h。繼續(xù)孵化1618h,，收獲細(xì)胞到玻璃纖維過濾器、[3 H]thymidine結(jié)合物用測試板計(jì)數(shù)器以每分鐘測量計(jì)數(shù)(cpm)。無血清培養(yǎng)液清、無轉(zhuǎn)鐵蛋白K1培養(yǎng)基洗細(xì)胞，在同一無血清培養(yǎng)基中使細(xì)胞饑餓3小時(shí)。胰蛋白酶 EDTA溶液獲取培養(yǎng)的NG細(xì)胞，離心(13 000g、5分鐘)，無血清培養(yǎng)液洗兩次， 不含轉(zhuǎn)鐵蛋白的K1培養(yǎng)基，用同樣的無血清培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)。(NG)培養(yǎng)于添加了10%(v?v)FBS和激素混合物（5 ug?mL胰島素、34pg/mL三碘甲狀腺氨酸、5ug/mL毫升轉(zhuǎn)鐵蛋白、?毫升亞硒酸鈉、8 ng氫化可的松和25ng?毫升表皮生長因子)的K1培養(yǎng)基(50 : 50 DMEM and Ham’s F12。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次?？刂平M細(xì)胞培養(yǎng)于單純SFF12培養(yǎng)基或含10%(v?v)FBS的SFF12培養(yǎng)基中。添加了不同形式(holo或apo)不同濃度的Hispurified植物源性rhTf或商業(yè)hTf標(biāo)準(zhǔn)，板子孵化時(shí)期不同(1 4天)。細(xì)胞鋪在60x15mm的培養(yǎng)皿里，在完全RPMI1640培養(yǎng)基，密度為每皿5x104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h。S（SFF12）培養(yǎng)液清洗。人上皮細(xì)胞株HeLa 229培養(yǎng)在添加了10%(v?v)ＦＢＳ，100Ｕ?毫升青霉素、?毫升鏈霉素和2毫米谷酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基中，３７℃、５％ＣＯ２和９５％空氣。銅綠假單胞菌在37℃、。隔夜培養(yǎng)基稀釋1:500 (v?v)至新鮮TB液體培養(yǎng)基，包含Hispurified的植物源性rhTf、商業(yè)apohTf標(biāo)準(zhǔn)，或者從HiTrap結(jié)合HP柱體洗脫的洗脫液，對照組81V9煙葉的TSP提取物，并以最初的OD600作為0時(shí)間取值。植物源性rhTf體外抗菌活性的評價(jià)通過植物源性rhTf抑制銅綠假單胞菌的生長能力評估其抗菌活性。6H2O titrated with 1 MNaHCO3]，然后進(jìn)行廣泛的PBS透析。植物源性整體型rhTF的制備從A465?A280 OD比判斷，Hispurified 植物源性rhTf不含鐵(例如，分離型的生產(chǎn))。鐵飽和人類轉(zhuǎn)鐵蛋白(holohTf) 　　 (A465?A280)，而人類無鐵apo轉(zhuǎn)鐵蛋白(apohTf)?A280比。簡單地說,大約5毫克的Hispurified 的植物源性rhTf，添加到1毫升含過量鐵的溶液[FeNH4(SO4)2 dissolved in M NaHCO3 to make1 ? 10)3M Fe3+].]。%SDSPAGE分析，然后用抗hTf抗體做免疫蛋白印跡檢測。在酶處理之前，樣品在變性緩沖液中煮沸10分鐘而變性。對于酶去糖基化，按照廠商說明，用縮氨酸N糖苷酶F（PNGases F）消化植物源性總蛋白提取液和Hispurified的rhTf。洗脫的rhTf部分，用大量PBS析出，通過4℃真空凝聚?？偣彩占蠹s5毫升上清液，加入HiTrap螯合HP柱體，緩沖液洗[10 mM imidazole, 20 mM Na2HPO4, 500 mM NaCl]，用于去除非特異性內(nèi)源性煙草蛋白質(zhì)。勻漿在4℃下13000g離心15min。植物源性rhTf的Hispurification按照廠商說明，利用HiTrap螯合HP柱體通過組氨酸親和層析，通過轉(zhuǎn)基因煙葉提取物純化獲得植物源性rhTf。通過每孔添加100uL終止液來終止底物反應(yīng)。三次PBST洗后，添加辣根過氧化物酶結(jié)合豬抗羊IgG抗體，室溫下孵育1h。每孔用PBST洗三次[phosphate buffered saline containing % (v ? v) Tween20]，室溫下在加了3%（V/V）BSA的PBST中培養(yǎng)2h。植物源性rhTf的定量檢測轉(zhuǎn)基因植物中積累的rhTf數(shù)量，采用間接酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）而量化，與作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)的已知量的hTf參考蛋白對比。在37℃的含5%脫脂牛奶的TBST[20 mM Tris, 150 mM NaCl, % (v ? v) Tween 20, adjusted to pH ]中封閉1h，薄膜在1:500(V/V)稀釋濃度的山羊抗hTf單克隆抗體中孵育2h，然后在兔抗山羊二抗結(jié)合辣根過氧化物酶中孵育（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA）。可溶性蛋白質(zhì)　　總濃度由Bradford方法決定，使用BioRad蛋白染色分析劑和以BSA作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)。簡言之，轉(zhuǎn)基因煙草植物的最上面的葉子組織，經(jīng)過液氮混勻且經(jīng)冷的緩沖萃取液中重懸浮[25 mM Tris(pH ), 50 mM NaCl, 2 mM bmercaptoethanol, 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride, 2 lg ? mL pepstain A and 2 lg ? mL leupeptin]。利用特定引物對，在100uL的總反應(yīng)體積中，大約有150ng首批合成的cDNA作為模板以行PCR擴(kuò)增。為引發(fā)最初的綜合反應(yīng)， ug的低聚糖（dT）1218引物退火為5ug的純化RNA，12uL的總反應(yīng)體積、70℃10min。通過使用特定的引物，總基因組DNA經(jīng)過PCR以確認(rèn)轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)入植物核基因組。隨著再生植物的成熟，它們就被轉(zhuǎn)移到溫室內(nèi)并培養(yǎng)以便進(jìn)一步分析。生成轉(zhuǎn)基因植物所有的植物轉(zhuǎn)化菌轉(zhuǎn)入土壤桿菌LBA4404，通過三親交配（Ma　et al., 2005）然后按Horsch等（１９８５）的方法引入低生物堿煙草cv. 81V9。6xHis標(biāo)簽和KDEL序列放置到融合蛋白的339。通過熔斷合成的DNA序列——編碼GLP1或GLP1的10串聯(lián)重復(fù)（hTfGLP1x10）（Brandsma et al., 2009）——到hTf編碼序列的339。完整表達(dá)卡座從pBlue35ShTf上移除，作為Sall/Xbal片段為其后克隆轉(zhuǎn)化成二元植物轉(zhuǎn)移菌pBIN 19（Bevan, 1984）生成最終植物轉(zhuǎn)化菌pRJChTf。Xbal位點(diǎn)由Xbal消化破壞，克萊治療（Klenow treatment）和其后的平齊末端結(jié)扎。pRTLGUS質(zhì)粒包括增強(qiáng)的花椰菜花葉病毒（CaMV）的雙35S（e35S）啟動(dòng)子和胭脂氨酸合酶（NOS）終止子序列。UTL序列從pRTLGUS解除的TEV（Carrington and Freed, 1990）作為EcoRI/Ncol片段，Ncol位點(diǎn)移除綠豆核酸，處理并在EcoRI和Smal位點(diǎn)之間插入pBluescript II SK()。hTf開放讀框架，作為EcoRV/Xbal片段解除pUC19hTf，并結(jié)扎至pBlueUTL在Xbal/Smal以產(chǎn)生PUTLhTf。得到的PCR產(chǎn)品平齊末端結(jié)扎至pUC19的Hincll位點(diǎn)，以產(chǎn)生DNA測序證實(shí)的完整pUC19hTf質(zhì)粒序列（Sequencing Facility。反向密碼子包含了一個(gè)改良的6組氨酸片段（下劃線），后面是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER保留信號KDEL（斜體），終止碼（雙下劃線）和Xbal位點(diǎn)。）啟動(dòng)子pCMV6質(zhì)粒聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）得到擴(kuò)增。）和反向（539。hTf的cDNA序列可以通過應(yīng)用設(shè)計(jì)的正向（539。此外，當(dāng)前的工作表明植物源性rhTf有潛力成為一個(gè)引人注目的特定細(xì)胞或口腔送遞多種治療分子的新送遞系統(tǒng)，允許其為未來的廣譜疾病開發(fā)新的治療藥物的可能性。雖然hTf有許多潛在應(yīng)用價(jià)值，但它尤其在醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域有巨大的意義，例如在人類轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏癥的治療、IR傷害、心血管疾病和其作為藥物送遞系統(tǒng)的有效性；當(dāng)前使用傳統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)的rhTf的小量生產(chǎn)率制約了其廣泛應(yīng)用?？偲饋碚f，在轉(zhuǎn)基因植物中，沒有報(bào)告有hTf的產(chǎn)生。 Johnson et al., 1988）。雖然有用，但內(nèi)化后Tf回到細(xì)胞表面的快速再循環(huán)可能顯著阻礙它作為藥物載體的效能。另一意義是 內(nèi)化的hTf融合蛋