db21t17493-20xx黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)規(guī)程doc(參考版)
2025-07-18 11:29本頁(yè)面
【正文】 ——————————11。如浸入太淺，則樣品液擴(kuò)散速度降低，甚至無(wú)法向上擴(kuò)散，同樣出現(xiàn)無(wú)效結(jié)果。 檢測(cè)試紙條浸入樣品液的深度：浸入深度不能超過(guò)“MAX”標(biāo)記。 樣品制備對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響明顯。以免吸濕而失效。 試紙條和快速診斷盒應(yīng)在2℃～8℃冰箱內(nèi)密封干燥保存?！?無(wú)效結(jié)果：質(zhì)控線和測(cè)試點(diǎn)線均未顯色，說(shuō)明試紙條失效，檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。—— 陽(yáng)性結(jié)果：質(zhì)控線顯粉紅色，測(cè)試線也顯粉紅色，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。測(cè)試觀察的時(shí)間以10 min～20 min為好。在檢測(cè)過(guò)程中，檢測(cè)條應(yīng)一直浸在樣品液中，直到檢測(cè)液爬至檢測(cè)膜的中部，取出放平，閱讀檢測(cè)結(jié)果。樣品端垂直向下，插入準(zhǔn)備好的樣品液中。使用前將試紙條或檢測(cè)盒恢復(fù)至室溫（15℃～30℃）。 將樣品葉片（半片至一片）放入制樣管中，充分進(jìn)行震蕩混勻，使樣品達(dá)到研磨效果，靜置待檢。附錄E(規(guī)范性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒快速診斷試紙條或檢測(cè)盒測(cè)定標(biāo)準(zhǔn) 植物樣品在檢測(cè)前需經(jīng)研磨，并用緩沖液稀釋。 結(jié)果記錄與資料保存完整的實(shí)驗(yàn)記錄包括：樣品的來(lái)源、種類、接收時(shí)間，實(shí)驗(yàn)的時(shí)間、地點(diǎn)、方法和結(jié)果等，并要有經(jīng)手人和實(shí)驗(yàn)人員的簽字。 樣品保存對(duì)于檢測(cè)結(jié)果顯示為陽(yáng)性的樣品，必須對(duì)樣品進(jìn)行保存?zhèn)洳?。在Image Master紫外成相系統(tǒng)（Pharmacia Biotech）上觀察結(jié)果并攝像。 RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè) 取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物用6loading buffer溶解，點(diǎn)樣。 PCR擴(kuò)增在冰浴上依次將下列組分加入PCR反應(yīng)管中，反應(yīng)采用50 μL體系。 RTPCR反應(yīng)體系 引物序列(CGMMV西瓜株系)—— 上游引物（Primer F）：5′ATGGCTTACAATCCGATCAC3′；—— 下游引物（Primer R）：5′CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGC3′。L異丙醇混勻后于室溫下靜置10 min，12000 r/min，4℃ 離心15 min，倒掉上清液，在沉淀物中加1 mL 75%的乙醇清洗1次，吸掉上清后室溫干燥3min～5 min，加入30 181。L氯仿渦輪震蕩15 s，室溫下放置5 min。將研缽、槍頭、離心管等放于DEPC水中37℃，浸泡24 h，取出后121℃滅菌30min ，烘干備用。其他試劑：液氮、氯仿、異丙醇、乙醇、瓊脂糖、溴化乙錠。L～1000181。L～200181。L～20181。附錄D(規(guī)范性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒RTPCR擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定(Polymerase Chain Reaction，PCR)標(biāo)準(zhǔn) 儀器設(shè)備PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析儀、冷凍離心機(jī)、電子天平（1/10 000g）、pH計(jì)、水浴鍋、振蕩器等。種子樣品應(yīng)保存在4℃冰箱內(nèi)，葉片和果實(shí)樣品應(yīng)保存在—20℃冰箱內(nèi)。另外各參照孔（包括底物孔、緩沖液孔、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照）測(cè)定值要符合試劑盒設(shè)定的目標(biāo)值；重復(fù)樣品孔的光密度值一致。根據(jù)試劑盒提供的方法和標(biāo)準(zhǔn)。L終止液，終止反應(yīng)。放入保濕盒內(nèi)，室溫（20℃~25 ℃）避光30～60 min。 加入底物試劑孵育結(jié)束前的15 min制備PNP底物溶液，加入PNP顯色劑，混合均勻，加入酶聯(lián)板，每孔100 181。L，放入保濕盒內(nèi)，室溫（20~25 ℃）孵育2 h。 洗滌。（待測(cè)樣品）在酶聯(lián)板中加入抗原(待測(cè)樣品)，同時(shí)加入陽(yáng)性指控物和空白對(duì)照（即樣品提取緩沖液），陽(yáng)性指控物、空白對(duì)照和待測(cè)樣品每孔內(nèi)加入100 181。L，放入保濕盒內(nèi)，4 ℃冰箱過(guò)夜。離心后4 ℃保存待用。 取樣方法取若干粒種子，去皮，加入樣品提取緩沖液（W/V=1：8）研磨勻漿，離心后4 ℃保存待用。 酶標(biāo)抗體緩沖液牛血清蛋白 ，PVP（分子量 2440,000） ，疊氮化鈉 ，溶解于1000mL 1X PBST中，4℃貯存。 2洗滌緩沖液（PBST）磷酸
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