國家標(biāo)準(zhǔn)-新城疫診斷技術(shù)【整理版】(參考版)
2025-07-17 19:33本頁面
【正文】 C 2 2 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物(Marker)為DLZ000。GB／T 1 65502008附錄B(資料性附錄)1％雞紅細(xì)胞懸液(RBc)制備采集至少三只SPF公雞或無禽流感和新城疫抗體的非免疫雞的抗凝血液，放入離心管中，加入 三倍～四倍體積的PBS混勻，以2 000 r／min離心5 rain 10 rain，去掉血漿和白細(xì)胞層，重復(fù)以上過 程，反復(fù)洗滌三次(洗凈血漿和白細(xì)胞)，最后吸取壓積紅細(xì)胞用PBS配成體積分?jǐn)?shù)為1％的懸液，于4℃保存?zhèn)溆谩? 1．44 g 磷酸二氫納(KHzPO。7GB／T 165502008附錄A (資料性附錄) pH7。8．2臨床診斷符合第3章規(guī)定的臨床癥狀和病理變化，按第7章進(jìn)行RTPCR檢測結(jié)果呈陽性且經(jīng) 序列分析證明F蛋白裂解位點(diǎn)具有強(qiáng)毒特征，診斷為新城疫?！岸?個堿性氨基酸”指在113位到116位殘基之間至少有三個精氨酸或賴氨酸。b)對于擴(kuò)增到的目的片段，需進(jìn)一步進(jìn)行序列測定，從分子水平確定其致病性強(qiáng)弱。7．3．5電泳 操作程序如下： a)制備1．5％瓊脂糖凝膠板；b)取5 pL PCR產(chǎn)物與0．5 pL加樣緩沖液混合，加入瓊脂糖凝膠板的加樣孔中；c)加入DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物；d)蓋好電泳儀，插好電極，5 V／cm電壓電泳，30 min～40 rain e)紫外線燈下觀察結(jié)果，凝膠成像儀掃描圖片存檔，打??； f)用分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物比較判斷PCR片段大小。循環(huán)條件為： a)第一階段，反轉(zhuǎn)錄42℃／45 rain； b)第二階段，預(yù)變性95℃／3 rain；c)第三階段，94℃／30 s，55℃／30 s，72℃／45 S，30個循環(huán)；d)第四階段，72℃／7 rain。在每個 PCR管中加入一滴液體石蠟(約20 pL)。表1 RTPCR反應(yīng)體系配置表試劑 體積／FL無RNA酶滅菌超純水 13．610緩沖液 2．5 dNTPs 2RNA酶抑制劑 0．5AMV反轉(zhuǎn)錄酶 0．7Taq酶 0．7 上游引物P1 1 下游引物P2 1 模板RNA 3總計(jì) 25注：上游引物P1的序列為5 7一ATGGGcYccAGAYcTTcTAc一3’，下游引物P2的序列為5’一CTGCCACT GcTAGTTGTGATAATcc 3 7，Y為兼并堿基。將適量的核酸樣品小心加入裝有反應(yīng)液體的反應(yīng)管內(nèi)，蓋5GB／T 165502008 緊蓋子并做好標(biāo)記。7．3．3配置RTPCR反應(yīng)體系 在樣品處理區(qū)內(nèi)由專人按表1給出的程序分步進(jìn)行。同時設(shè)立陽性對照和陰性對照。應(yīng)保證無細(xì)菌及核酸污染，實(shí)驗(yàn)材料和容器應(yīng)經(jīng)過消毒處理并一次性使用。7．3。7．3操作程序7．3．1樣品的采集和處理取200 pL離心后的上清提取RNA。7反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTPCR)7．1儀器設(shè)備 所用儀器設(shè)備如下： a)PCR儀；b)高速臺式冷凍離心機(jī)：最大離心力12 0009以上；c)生物安全柜} d)冰箱； e)水浴鍋； f)微量移液器； g)組織勻漿器； h)電泳儀； i)電泳槽； j)紫外凝膠成像儀。4GB／T 1 65502008 b)尿囊渡HA效價大于等于41092，且標(biāo)準(zhǔn)新城疫陽性血清對其HI效價大于等于4 l092，判為新城疫病毒。滴度是指產(chǎn)生完全不凝集(紅細(xì)胞完全流下)的最高稀釋度。當(dāng)PB
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