【正文】 2. 如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損?建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。然而，若存放于4℃時，請勿超過一個月。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。分離培養(yǎng)物，檢測支原體。接種細胞起始濃度太低：細胞已老化支原體污染增加接種細胞起始濃度。培養(yǎng)液需在2－8℃避光保存?；蛴每股爻?。補加谷氨酰胺或生長因子。讓細胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗。培養(yǎng)物中有少量細菌或真菌污染。換入新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞生長減慢：由于更換不同培養(yǎng)液或血清。注意：大多數(shù)哺乳動物細胞能耐受滲透壓為260 – 350 mOsm/kg。培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積。細胞凍存或復蘇過程中損傷。培養(yǎng)細胞死亡：培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2。用DNase I 處理細胞。分離培養(yǎng)物，檢測支原體。蛋白酶過度消化使得細胞裂解釋放DNA。懸浮細胞成簇：培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子。清潔支架和培養(yǎng)箱。縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。支原體污染?；蛴每股爻⑴囵B(yǎng)液加熱到37℃，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。冰凍保存培養(yǎng)液。丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。加HEPES 緩沖液至10 到25mM 終濃度。（2）改用不依賴CO2 培養(yǎng)液。細菌、酵母或真菌污染。NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。細胞分離試劑（1）大部分連續(xù)細胞系，強貼壁細胞系，許多早代細胞：HBSS或無鈣鎂PBS％胰蛋白酶溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中細胞表面蛋白完整性重要的連續(xù)細胞系：HBSS或無鈣鎂PBS％ EDTA弱貼壁表皮細胞轉(zhuǎn)化成纖維細胞（要求細胞表面完整性），原代細胞：HBSS或無鈣鎂PBSEDTA,甘油 溶解在檸檬酸鈉中強貼壁早代細胞系：HBSS或無鈣鎂PBS％胰蛋白酶溶解在1mM EDTA，Dispase 細胞分離試劑（2）上皮細胞： 1mM EDTA 1mM EDTA，Dispase 強貼壁細胞，上皮細胞，一些腫瘤細胞： 1mM EDTA％胰蛋白酶1mM EDTA，Dispase 厚培養(yǎng)物，多層富含膠原的密集培養(yǎng)：1mM EDTA％胰蛋白酶，200單位/ml膠原酶，1mM EDTA溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中培養(yǎng)液pH 值變化太快：CO2 張力不對。在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。38大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。37一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。36血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。Eagles液在空氣水平的CO2中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。原因是什么？Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和Earle‘s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？ HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles ()中比在Hanks () 中高。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。33二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？ 二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。 GlutaMAXI二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAXI 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L谷氨酰胺幾乎完全降解。30 GlutaMAXI是什么？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAXI？這個二肽有多穩(wěn)定？ GlutaMAXI 二肽是一個L谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha氨基用L丙氨酸來保護。L谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。29 L谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？ L谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。在MEM中培養(yǎng)的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？ 冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。細胞置于–80 176。懸浮細胞誤認為死細胞。解凍過程錯誤。26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？ 研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。25 購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形？ 研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少， 大都是因為離心過程操作上的失誤， 造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。若培養(yǎng)基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。C 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？ 培養(yǎng)基保存于4 176。22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？ 定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasmafree，實驗結(jié)果之數(shù)據(jù)方有意義。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。直接滅菌后丟棄之。嚴格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。升級篇細胞培養(yǎng)416 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細胞濃度？ 冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。C 不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入80176。C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降13 176。C30 分鐘*) → 80 176。15 冷凍保存細胞之方法？ 冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 176。C， 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機會。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。 升級篇細胞培養(yǎng)311 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？ 欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 10 分鐘， 過高之轉(zhuǎn)速， 將造成細胞死亡。10 懸浮性細胞應(yīng)如何繼代處理？ 一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中， 保存于–20 176。8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。當培養(yǎng)基中NaHCO3 g 時，細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10 % CO2；當培養(yǎng)基中NaHCO3 g 時， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細胞。HS (horseserum) 則是指馬血清。升級篇細胞培養(yǎng)25 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源， 所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細胞大都無法立即適應(yīng)， 造成細胞無法存活。2 細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應(yīng)馬上去除DMSO？ 除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有1015ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。blue 混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數(shù)盤，計數(shù)四大方格內(nèi)之細胞數(shù)目。 . 范例： T75 monolayer culture 制成10ml 細胞懸浮液， ml trypan一般使用藍色之trypan blue 染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml 中之細胞數(shù)目。. 血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber 中細刻9 個1 mm2 大正方形，其中4 個角落之正方形再細刻16 個小格， mm。隔天后，于無菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約510ml 培養(yǎng)基于flask 內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再將細胞置入培養(yǎng)箱中，或細胞已長滿盤， 則將細胞做傳代培養(yǎng)。C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱中，使細胞回溫至37 176。請檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，若有任何問題， 不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 . 對絕大多數(shù)細胞而言，1 % 以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除， 待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內(nèi)之培養(yǎng)基， 混合均勻，放入37 176。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部， 移入無菌操作臺內(nèi)。取出冷凍管， 立即放入37 176。. 將培養(yǎng)基置于37 176。絕大多數(shù)之細胞均無法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類， 若因?qū)嶒炐枰?必須有所不同時， 務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成， 確定細胞適應(yīng)后， 方進行所需之實驗。C， 隔夜后， 移到液氮)?；A(chǔ)篇收到細胞的處理方式 (一)1. 收到細胞株包裹時， 請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請立即通知。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有510 ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 ml 解凍細胞懸浮液作存活測試。C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。2. 細胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。 . 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機中，再放入液氮槽中。. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為15 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。 . 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為510％，混合均勻，置于室溫下待用。適用于懸浮型細胞與hybridoma 之保存。. 冷凍方法： . 傳統(tǒng)方法: 4℃ 10 分鐘 20℃ 30 分鐘 80℃ 16 18 小時(或隔夜) 液氮槽vapor phase 長期儲存。 . other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml。 . adherent tumor lines: 5~7 x 106，依細胞種類而異。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色( micronFGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D2650)，以5~10 ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。. 冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。 . 融合瘤(hybridoma) . 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會失去抗體。. 懸浮型細胞(suspension cell) . 吸出細胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。(若不移去trypsinEDTA，則在trypsinEDTA 作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。 . 用DPBS 洗滌細胞一至二次。2. 材料： . 無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’s phosphatebuffered saline, Ca++/Mg++ free, DPBS, GibcoBRL 21600010) . trypsinEDTA solution (% EDTA4Na, GibcoBRL 25300062)： 以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃ 水槽回溫。 9. 以肉眼計數(shù)群落數(shù) 10. 計算SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 % 11. 計算RPE(Relative Plating Efficiency