【正文】 。6 記錄與計(jì)算詳細(xì)記錄檢驗(yàn)過程，并根據(jù)雞胚特異死亡數(shù)按照以下公式(Karber 氏法)計(jì)算檢品的ELD50。 根據(jù)檢品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)確定雞胚的觀察時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)檢查雞胚是否因接種物引起的特異性死亡，檢驗(yàn)雞新城疫中等毒力活疫苗時(shí)可吸取尿囊液做紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。 每日照蛋，24小時(shí)前死亡雞胚視為非特異死亡棄去不記，以后隨時(shí)取出死亡雞胚放2～8176。 尿囊腔途徑接種時(shí)選取9～10日齡雞胚，絨毛尿囊膜途徑接種時(shí)選取10～11日齡雞胚，作好蛋殼表面消毒后，打眼或做人工氣室。 。 準(zhǔn)備好試管和吸管等試驗(yàn)器具。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF雞胚或健康易感雞胚。 嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作。1 技術(shù)依據(jù)及原理病毒含量的高低直接反映了產(chǎn)品的質(zhì)量，因此用雞胚接種測定病毒含量可作為判定產(chǎn)品質(zhì)量的依據(jù)。6 記錄與計(jì)算詳細(xì)記錄檢驗(yàn)過程和結(jié)果，并根據(jù)雞胚感染數(shù)按照以下公式(Karber氏法)計(jì)算檢品的EID50。 根據(jù)檢品的種類和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求確定雞胚的觀察時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，檢查雞胚病變，或吸取尿囊液作紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)以判定雞胚是否感染。 每日照蛋兩次，接種后24小時(shí)前（雞新城疫低毒力活疫苗為接種后48h前）死亡雞胚作為非特異死亡胚棄去不記，以后隨時(shí)取出死亡雞胚，放4～8186。取后三個(gè)稀釋度，經(jīng)雞胚尿囊腔途徑接種，每個(gè)稀釋度接種雞胚5枚，接種后用石蠟密封接種孔并置37186。 將生理鹽水加入到疫苗瓶中，按檢品瓶簽注明的羽份加入適量生理鹽水， ml加到0試管中(1羽份／)，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行10倍系列稀釋，根據(jù)檢品的種類和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)確定合適的稀釋滴度。 取一定數(shù)量的試管依次排列到試管架上，分別標(biāo)明0、2等。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF雞胚或健康易感雞胚 樣品 每批樣品1瓶 其他 檢驗(yàn)記錄紙、筆4 檢驗(yàn)步驟 隨機(jī)抽取檢品1瓶，放置在操作臺(tái)上。 試劑 滅菌生理鹽水，雞紅細(xì)胞懸液。2 注意事項(xiàng) 所用雞胚必須為SPF或健康易感雞胚 嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作。甲醛溶液含量標(biāo)定 ，精密稱定，置錐形瓶中，加水10ml，與溴麝香草酚蘭指示液2滴，滴加氫氧化鈉滴定液（1mol/L）至溶液呈藍(lán)色，加過氧化氫試液25ml，瓶口置一玻璃小漏斗，在水浴上加熱15分鐘，不時(shí)振搖，冷卻，用水洗滌漏斗，加溴麝香草酚蘭指示液2滴，用鹽酸滴定液（1mol/L)滴定至溶液顯黃色，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。醋酸液40ml與醋酸銨液1000ml混合，只冷暗處保存。 甲醛溶液（40%）含量%(g/ml)=（供試品溶液的吸收度/對照品溶液的吸收度）%附注：試液制備1 醋酸 醋酸銨緩沖液()醋酸液 醋酸（AR）。A2)A1 供試品溶液的吸收度 A2對照品溶液的吸收度 對照品溶液的濃度% (按40%計(jì)) 結(jié)果判定將檢驗(yàn)結(jié)果與產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比，按照產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進(jìn)行判定。 記錄與計(jì)算甲醛（按40%計(jì)）含量%=(247。 供試品溶液的制備用5ml刻度吸管量取本品5ml，置50ml量瓶中，用20吐溫—80乙醇溶液10ml，分次洗滌吸管，洗液并入50ml量瓶中，搖勻，加水稀釋至刻度，強(qiáng)烈振搖，靜置分層，下層液如不澄清，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液即得。醋酸液40ml 與醋酸銨液1000ml混合，置冷暗處保存。P%100W=取已測定含量的甲醛溶液的量（mg） P%=測定的甲醛溶液的含量 試液制備 醋酸——醋酸銨緩沖液（）醋酸液 醋酸（AR）。W100%V空白=空白滴定消耗鹽酸滴定液的ml數(shù) V滴=滴定消耗鹽酸滴定液的ml數(shù)F=鹽酸滴定液的濃度校正因素T=每1ml氫氧化鈉滴定液（1mol/l）相當(dāng)于甲醛的mg數(shù)， 對照品溶液的配制取上述已測定含量的甲醛溶液適量，精密稱定，置100ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取上述溶液5ml于50ml量瓶中，加20%吐溫—80乙醇溶液10ml，再加水至刻度?？瞻自囼?yàn) 取過氧化氫試液25ml和精密量取氫氧化鈉滴定液（1mol/l）25ml，置錐形瓶中，加水10ml與溴麝香草酚藍(lán)指示液2滴，用鹽酸滴定液(1mol/l)滴定至溶液顯黃色。 甲醛溶液的含量測定取甲醛溶液（GR或AR），精密稱定，置錐形瓶中，加水10ml，溴麝香草酚藍(lán)指示液2滴，滴加氫氧化鈉滴定液（1mol/l）至溶液呈藍(lán)色，加過氧化氫試液25ml，再精密加入氫氧化鈉滴定液（1mol/l）25ml，瓶口置一小漏斗，在水浴上加熱5分鐘，不時(shí)振搖，冷卻，用水洗滌漏斗，加溴麝香草酚藍(lán)指示液2滴，用鹽酸滴定液（1mol/l）滴定至溶液顯黃色，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正，即得。標(biāo)定一般要做3份，%。（VT）W=稱取的基準(zhǔn)無水碳酸鈉的量（mg）；V=滴定時(shí)消耗的鹽酸ml數(shù)。每1ml的鹽酸滴定液（1mol/l），算出鹽酸滴定液的濃度，用F值表示。 甲基紅—溴甲酚綠乙醇混合指示液的配制%甲基紅乙醇溶液20ml，搖勻即得。 試驗(yàn)器具稱量瓶；250ml 錐形瓶；50ml 量瓶；5ml移液管和5ml吸管；1ml；10ml量筒；125ml分液漏斗；水浴鍋等。3 材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求 儀器及設(shè)備紫外 — 可見分光光度計(jì)，精密天平和高溫箱等。2 注意事項(xiàng)本方法測定時(shí)如果由于產(chǎn)品中甲醛的含量過高，使吸收值過大時(shí)可減少取樣量，或擴(kuò)大供試品的稀釋倍數(shù)。1 技術(shù)依據(jù)及原理本方法與英國藥典和歐洲藥典的方法原理基本一致。本液應(yīng)臨用新制。本品應(yīng)置棕色瓶內(nèi)，再冷暗處保存。 結(jié)果判定將檢驗(yàn)結(jié)果與產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比，按照產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進(jìn)行判定。V2)(247。ml分液漏斗，加水80ml，20%鹽酸羥胺溶液5ml，操作同上。 供試品溶液滴定將上述消化液移入125ml分液漏斗，用水多次洗滌凱氏燒瓶，使總體積為80ml，加20%鹽酸羥胺溶液5ml，搖勻，開始時(shí)每次滴加3ml左右，以后逐漸減少，每次加入滴定液后，強(qiáng)烈振搖10秒鐘，靜置分層，棄去四氯化碳層，繼續(xù)滴定，直至雙硫腙的綠色不變，即為終點(diǎn)。（4） mol/l硫酸溶液取硫酸30ml，緩緩注入適量水中，冷卻至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻即得。(2)%雙硫腙溶液%雙硫腙溶液2. 5ml 加四氯化碳稀釋至100ml。 試液制備(1)%雙硫腙溶液取雙硫腙50mg加氯仿100 ml溶解即得。精密量取5 ml，置100 ml量瓶中，搖勻，即得。3 材料 儀器及設(shè)備精密天平，烤箱等。 凱氏燒瓶和分液漏斗不宜用太大的，否則影響結(jié)果和終點(diǎn)觀察。如：M=℃時(shí)D= 。2 注意事項(xiàng) ，可以取接近數(shù)值。 當(dāng)疫苗與特異性血清中和后，接種動(dòng)物、雞胚或接種宿主細(xì)胞似有一定反應(yīng)，懷疑此疫苗未被完全中和所致，可選用更高效價(jià)的特異性血清重檢。95％的雞馬立克氏疫苗判為特異。陽性對照平均蝕斑數(shù)樣品中和平均數(shù)蝕斑減少率 ＝ 100％陽性對照平均蝕斑數(shù) 6 結(jié)果判定按產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)判定 疫苗與特異性血清中和后，接種動(dòng)物或雞胚無臨床反應(yīng)和組織病理變化；接種宿主細(xì)胞不產(chǎn)生病變（CPE）；且與“對照”（其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定需設(shè)的）差異明顯，判該特異性血清中和試驗(yàn)結(jié)果陰性，即該疫苗特異。接種“疫苗中和物”和“陽性對照物”的細(xì)胞應(yīng)有典型、清晰、形態(tài)不規(guī)則、邊緣不整齊、～（而正常細(xì)胞則無）。特別是接種動(dòng)物、雞胚的臨床反應(yīng)，及組織、病理變化和接種細(xì)胞的病變程度或蝕斑數(shù)。 用過的吸管、注射器等器具和污染、廢棄物要先行消毒處理，再行清洗或丟棄。必要時(shí)，還應(yīng)戴上手套。 待瓊脂（糖）層凝固后，將細(xì)胞瓶倒置于37℃～38℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5～7天。 取出上述細(xì)胞瓶，倒去營養(yǎng)液。 制備營養(yǎng)瓊脂（糖）。同時(shí)，取正常細(xì)胞1瓶，換以相同營養(yǎng)液。 將上述接種細(xì)胞瓶移至37℃～38℃培養(yǎng)箱中吸附1小時(shí)。 任取上述細(xì)胞3瓶，用記號筆標(biāo)記為“中和”。 蝕斑技術(shù)（適用于雞馬立克氏病活疫苗） 按常規(guī)方法制備雞胚成纖維細(xì)胞單層。 逐瓶檢查瓶口是否塞緊，標(biāo)記是否正確等。根據(jù)接種物的特性，也可不經(jīng)吸附，直接補(bǔ)加細(xì)胞維持液；甚或可將接種物加入定量的細(xì)胞維持液中，混勻后直接接種細(xì)胞）。 任取上述細(xì)胞3瓶，每瓶用吸管接種相當(dāng)該細(xì)胞瓶生長液量20％的陽性對照物，用記號筆標(biāo)記為“+”。 任取上述細(xì)胞3瓶，每瓶用吸管接種相當(dāng)該細(xì)胞瓶生長液量20％的疫苗中和物，用記號筆標(biāo)記為“中和后”。 任取上述細(xì)胞1～2瓶，每瓶按原液量，用吸管換入新的細(xì)胞維持液。 按常規(guī)方法制備細(xì)胞單層。 接種雞胚取疫苗中和物及對照物，按其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的雞胚日齡、數(shù)量、接種途徑、劑量，分別接種雞胚。取出試管，排放于試管架上。 按其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的中和溫度及中和時(shí)間，核對水浴鍋溫度無誤后，將上述試管輕輕振搖、混勻后置水浴中和，上好定時(shí)鐘，由專人值守。 取適宜吸管，吸取與疫苗稀釋液等量的特異性血清，分別加入到“中和”及“陰性對照”管中。 根據(jù)每批疫苗與血清的中和用量，取適宜滅菌試管1～3支，分別用記號筆標(biāo)明“中和”、“陰性對照”、“陽性對照”等字樣，順序排放于試管架上（產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中不設(shè)“對照”的除外）。 中和 打開水浴鍋電源，設(shè)置溫度，調(diào)整好水溫。 稀釋疫苗 每批疫苗任取樣1瓶（另有規(guī)定除外），用該產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的稀釋液，按其含量作10倍系列稀釋至質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的稀釋劑量。 試驗(yàn)器具試管及試管架若干，吸管（1ml、5ml、10ml），注射器（1ml，5ml，10ml）及針頭（4?！?＃），蛋盤，打孔器，石臘，細(xì)胞瓶及瓶塞 試驗(yàn)動(dòng)物家兔（～，用于豬瘟疫苗），雞胚（SPF胚，9～11日齡，用于雞新城疫、支氣管炎疫苗） 細(xì)胞（根據(jù)待檢疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)選用適宜細(xì)胞，按常規(guī)方法制備成良好單層） 樣品 每批疫苗任取1～3瓶。3 試驗(yàn)材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求 儀器及設(shè)備超凈工作臺(tái)（雙人、垂直），恒溫水浴鍋，計(jì)