【正文】 在此對(duì)他們的善心幫助表示誠(chéng)摯的謝意！感謝我的爸爸媽媽，感謝他們對(duì)我的無私奉獻(xiàn)和深切的關(guān)心，沒有他們對(duì)我學(xué)業(yè)的支持和為人處事的教育，就沒有今天的我，在這兒請(qǐng)讓我說一句，爸媽你們辛苦了！你們永遠(yuǎn)的健康和快樂是我最大的心愿！此外，還要感謝在大學(xué)四年中幫助過我的人，同時(shí)也感謝學(xué)院為我提供良好的做畢業(yè)論文的環(huán)境。在此，謹(jǐn)向楊忠華老師致以誠(chéng)摯的謝意和崇高的敬意！感謝趙燕師姐，以及楊芳芳師姐，蘿莉師姐，和常煦師兄，在實(shí)驗(yàn)室的時(shí)候，他們總是友好耐心地為我講解一些疑難問題，給了我很大的幫助。每周的例會(huì)讓我學(xué)會(huì)了總結(jié)和獨(dú)立思考。授人以魚不如授人以漁，置身其間，耳濡目染，潛移默化，使我深深地收到了熏陶和感染，楊忠華老師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度和精益求精的工作作風(fēng)深深地感染和激勵(lì)著我。參考文獻(xiàn)[1] 、鑒定及其生長(zhǎng)條件和產(chǎn)酶活性的研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2009.[2] 韓立榮，張雙璽，祝傳書，[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,0~174.[3] 汪金萍,徐爾尼,[J].食品科技,2007(2)：73~76.[4] Wang J P, Xu E N, Shi L K，et a1．Study on the method of increasing cellulose production[J]．Food Science and Technology, 2007(2): 7376．(in Chinese)[5] [D].,5~8.[6] Woodward J,M．Lirna39。(3)通過發(fā)酵培養(yǎng)和纖維素CMC酶活以及FPA酶活測(cè)定，江白（即白地霉）產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，在CMC培養(yǎng)條件下達(dá)到40U,。4 結(jié)論(1)利用初篩培養(yǎng)基CMC培養(yǎng)基，從土壤中分離到6株降解纖維素真菌，且都具有較強(qiáng)的纖維素降解能力。鑒于此，本文僅僅鑒別出了深綠木霉，白地霉，黑曲霉。篩選所得菌株都可以使明膠液化，使硝酸還原，其中江短毛還原能力最強(qiáng)；江長(zhǎng)毛，江短毛，以及瘤黑可以水解淀粉；江長(zhǎng)毛可以產(chǎn)生硫化氫，兩管紙綠試管中有一管能產(chǎn)生硫化氫，另一管沒有現(xiàn)象。但是是什么原因影響了在FPA培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株的產(chǎn)酶能力還有待研究。又在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，紙綠的總量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于江白，所以后者的產(chǎn)酶能力實(shí)際上更強(qiáng)。 各菌的酶活力測(cè)定結(jié)果 ： 菌株的CMC酶活（CMC培養(yǎng)基）測(cè)定結(jié)果菌株紙綠江白江土江長(zhǎng)毛江短毛瘤黑吸光度酶活（U）50吸光度酶活（U） 菌株的FPA酶活（CMC培養(yǎng)基）測(cè)定結(jié)果菌株紙綠江白江土江長(zhǎng)毛江短毛瘤黑吸光度 酶活（U）吸光度酶活（U） 菌株的FPA酶活（FPA培養(yǎng)基）測(cè)定結(jié)果菌株紙綠江白江土江長(zhǎng)毛江短毛瘤黑吸光度 酶活（U）吸光度酶活（U）各菌的酶活性和各個(gè)菌株的產(chǎn)酶能力有一定的差異，說明各個(gè)菌株間的產(chǎn)酶能力有顯著性差異。據(jù)此鑒定為白地霉。在液體培養(yǎng)時(shí)生白醭，毛絨狀。 江短毛菌株在顯微鏡中的形態(tài)：在400倍電子顯微鏡下觀察所得 短毛霉在PDA培養(yǎng)基上（反面）生長(zhǎng)情況 短毛霉在PDA培養(yǎng)基上（正面）生長(zhǎng)情況(6)江白：在PDA瓊脂培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，菌落一直為白色，石膏樣，后期中間顯示一圈一圈的黑色，無毛，光滑，背面為白色。：在400倍電子顯微鏡下觀察所得 長(zhǎng)毛在PDA培養(yǎng)基上（反面）生長(zhǎng)情況 長(zhǎng)毛在PDA培養(yǎng)基上（正面）生長(zhǎng)情況 長(zhǎng)毛在PDA培養(yǎng)基上（反面）生長(zhǎng)情況(5)江短毛：在PDA瓊脂培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，菌落顯白色，菌絲較短，光滑，背面顯紅色。在PDA上生長(zhǎng)一般。, 。上分生孢子頭狀如“菊花”。菌叢黑褐色，頂囊大球形，小梗雙層，分生孢子為球形，呈黑色，粗糙且干燥。,。[18]。菌絲體有隔，透明，分枝繁茂，孢子梗分枝不翹則，對(duì)生或互生并有多極分枝而呈松柏狀，分支末端為小梗。菌落背面無色略灰色。 菌種保藏 紙綠，江白，江長(zhǎng)毛，江短毛，江土利用PDA培養(yǎng)基保藏于80 ℃冰箱中，瘤黑利用改良的馬丁培養(yǎng)基保藏與80 ℃冰箱中。 3）將接種了待鑒定菌株的試管和空白對(duì)照試管放置在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。因此在培養(yǎng)基中加熱硫化氫也是鑒定菌種的一種方法，具體如下：1）將剛滅菌的已溶化的柴斯納瓊脂培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，分裝于已滅菌的試管中，豎直置于30 ℃溫箱中過夜。 硫化氫的產(chǎn)生 某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸，生成硫化氫。 3）將接種了待鑒定菌株的斜面和空白對(duì)照斜面放置在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 類黑色素的產(chǎn)生1）將剛滅菌的已溶化的酪氨酸培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，分裝于已滅菌的試管中制成斜面，置于30 ℃恒溫箱中過夜。 4）培養(yǎng)了514 d，分別觀察記錄生長(zhǎng)情況。 3）將接種了待鑒定菌株的試管和空白對(duì)照試管放置于大小適宜的燒杯中固定。 碳源利用1）將剛滅菌的各種碳源利用培養(yǎng)基放置于無菌操作臺(tái)冷卻。測(cè)定時(shí)，培養(yǎng)液倒出少許于干凈離心管中，分別加入硝酸鹽還原試劑A液和B液各2滴，如呈粉紅色、玫瑰紅色、橙色或棕色等時(shí)，即為陽性。置于30 ℃，150 r/min的搖床中培養(yǎng)。 2）將待鑒定的菌株接種于試管中，另留兩管作為空白對(duì)照。如果培養(yǎng)基中的硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽，當(dāng)培養(yǎng)液中加入格里斯氏試劑時(shí)，則溶液成粉紅色、玫瑰紅色、橙色或棕色等。如菌種能在濾紙條上生長(zhǎng)，并分解紙條成一團(tuán)松散纖維，或使之折斷、碎裂成粉質(zhì)狀，表示該菌株產(chǎn)生纖維素酶，若紙條不被分解，則該菌株不產(chǎn)生纖維素酶。 3）將接種了待鑒定菌株的試管和空白對(duì)照試管放置于試管架中，置于30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 纖維素水解試驗(yàn)1）將剛滅菌的纖維素水解培養(yǎng)基放置于無菌操作臺(tái)冷卻。 5）如菌苔周圍出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉已被水解，為陽性。4）觀察各種細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)34 d，多數(shù)菌株已生長(zhǎng)成熟。 2）將待鑒定的菌株在不同的板上劃線接種。淀粉水解后，遇碘不變藍(lán)色。液化程度有快、慢、強(qiáng)、弱之分。 4）分別在第3 d、5 d、10 d觀察各試管的液化程度。（每種菌均接兩管作為平行對(duì)照）。 生理生化特性鑒定 明膠液化試驗(yàn)1）滅菌的已溶化明膠液化培養(yǎng)基無菌操作分裝于已滅菌的6支試管中，豎直放置于30 ℃恒溫箱中過夜。 培養(yǎng)特征觀察 將菌株分別接種在CMC培養(yǎng)基平板上，于30 ℃培養(yǎng)，分別于7 d、15 d和30 d肉眼觀察其培養(yǎng)特征及顏色變化，取成熟期的顏色作為定種的依據(jù)，觀察和記錄如下項(xiàng)目： ① 氣生菌絲體顏色(指孢子絲未形成前的顏色)； ② 孢子絲和孢子的顏色(即成熟孢子堆的顏色)； ③ 基質(zhì)菌絲體的顏色(即菌落背面的顏色)。 形態(tài)特征觀察 菌落形態(tài)觀察 純化了的菌株分別劃線和點(diǎn)種于平板上，30 ℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。g葡萄糖定義為1個(gè)纖維素酶活力單位。 ()y代表縱坐標(biāo)，b代表截距，k代表斜率；xl代表利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的相應(yīng)葡萄糖濃度；x2代表酶液作用一定量底物后生成的葡萄糖的濃度。 酶活力計(jì)算方法 葡萄糖濃度計(jì)算公式： 根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，將吸光度值代入一元線形回歸方程，即可得到葡萄糖的濃度：x=(y+b)/k(ug/m1) 。因此本試驗(yàn)采用DNS法來測(cè)定纖維素酶活力的大小，具體操作方法如下： 以2 ml %CMC溶液為底物(， mo1/l Na2HP04, mol/l檸檬酸緩沖液配制)，加200 μl上清液，再加2800 μl蒸餾水，于50 ℃保溫30 min，然后加人2 ml DNS試劑，沸水浴5 min，然后一起放入涼水至室溫，在540 nm測(cè)光密度值(OD540nm)，以相應(yīng)空白樣(2 %CMC溶液為底物，3 ml滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)液，于47 ℃保溫30 min，然后加入2 mL DNS試劑，沸水浴5 min，然后一起放入涼水至室溫。 CMC酶活測(cè)定 酶活力測(cè)定中大都采用DNS法來測(cè)定還原糖的生成量，因?yàn)樵摲ê?jiǎn)易、靈敏度較高，但是由于纖維材料水解的是包括葡萄糖、纖維二糖及幾種纖維寡糖的混合物，因此以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)反映出的還原糖生成量與實(shí)際還原糖的生成量有一定的差異，這種差異很小，一般的定糖方法無法解決，只有用高效液相色譜(HPLC)等分析方法才能實(shí)現(xiàn)[16]。因?yàn)閯偣t纖維素平板篩選法受菌苔大小、菌苔在平板上的堆積情況、菌落之間相互位置和產(chǎn)物或分泌物的相互抑制、不同菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶速度、不同細(xì)菌細(xì)胞壁的特性等因素的影響，并不能精確反應(yīng)纖維素酶活力的大小[15]。然而，雖然透明圈大小直接反映了酶濃度的高低，但不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力。 酶活力測(cè)定方法 關(guān)于纖維素酶活力的測(cè)定方法很多，至今也沒有統(tǒng)一定論，而且用不同方法測(cè)定，結(jié)果也存在一定差異。用1000 μl移液槍量取500 μl轉(zhuǎn)接于250 ml三角瓶中的50 ml培養(yǎng)基中，于30 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，在4 ℃，8000 r/min離心20 min除去菌體。各取4 ml加入到已作好標(biāo)記的帶有刻度的試管中，再分別加入DNS試劑2 ml，加熱煮沸5 min，取出置冷水中冷卻，定容至6 ml，在722型分光光度計(jì)上