【正文】 四、作業(yè)總結(jié)體外授精的過程，描繪卵母細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，描述體外培養(yǎng)過程中受精卵的發(fā)育形態(tài)。受精后40—44h檢查受精卵的分裂率。然后，每孔放入50—100枚已經(jīng)培養(yǎng)成熟的卵母細胞和經(jīng)處理的精子，精子在受精液滴中的最終濃度同上。不同的公牛要求不同的精子濃度，因此，使用不同公牛時，應(yīng)預(yù)先測定該公牛所需的精子最佳濃度。其做法是先在培養(yǎng)皿中用受精液制作成20ul或40ul的微滴并覆蓋石蠟油，置于CO2培養(yǎng)箱中平衡至少2h。 腎上腺素 亞牛黃酸 —— 葡萄糖 NaHCO3 濃度（mmol/L） 組成成分 濃度（mmol/L） 組成成分 通常使用的受精液是Tyrode’s改良液，其主要成分見下表。 受精液 一般使用的高滲溶液為360—380mosm。 （3）高滲溶液處理法不同的公牛要求不同濃度的肝素，故當使用不同公牛精液時，應(yīng)預(yù)先測定該公牛所需的最佳肝素濃度。 此法是目前最為廣泛應(yīng)用的精子獲能處理方法。 （1）肝素處理法精子的獲能處理一般有如下三種方法。 將精液直接放入含有5—10ul的獲能液或受精液的離心管中，而后離心2次即可。 （2）直接離心法 將1—2支細管冷凍精液解凍后，放入含有3—5ul的獲能液或受精液的試管底部，在培養(yǎng)箱中孵育約30min后，用吸管吸取上半部分液體并離心洗滌1—2次，即可獲得90%以上活力強的精子。因為精子活力的強弱直接影響到受精的效果。 用于體外受精的精液一般為冷凍精液，冷凍精液中除了富含精漿外，還含有防凍劑、卵黃或牛奶等成分，受精前必須把這些成分棄掉，以利于卵母細胞受精過程的完成。 卵母細胞要完成體外受精過程，其先決條件是需要成熟的卵子和精子，其次，亦依賴于受精的環(huán)境等因素。 （三）卵母細胞的體外受精 牛和羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的時間一般為22—24h，而馬為30—36h。牛、豬、羊和馬等家畜的卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的溫度一般為38—39℃，人和齒類動物為37℃。 如培養(yǎng)單個卵母細胞，則制備10ul的微滴。 使用時需添加一定濃度的血清、促性腺激素和雌激素等。三、實驗內(nèi)容 二、實驗材料了解卵母細胞體外培養(yǎng)與體外受精的程序和操作要領(lǐng)，掌握卵母細胞體外培養(yǎng)與體外受精的方法。 卵母細胞體外培養(yǎng)與體外受精四、作業(yè)總結(jié)手術(shù)法和非手術(shù)法胚胎移植的程序和主要技術(shù)環(huán)節(jié)。 同牛的胚胎檢驗胚胎的移植①麻醉手術(shù)法同供體②用輸卵滴管吸取正常胚胎（帶小量液體）注入輸卵管的腹腔孔。將供體羊麻醉后，在腹中線或腹側(cè)作一切口，先將一側(cè)輸卵管及子宮角移出腹腔，用注射器吸取沖卵液注入子宮角尖端，在輸卵管的傘部接取沖卵液。供體羊在發(fā)情周期第16天開始注射FSH 100IU，每天一次，共三次，并在第17天注射PGF2α2mg，供體羊發(fā)情結(jié)束配種，并注射LH 150IU,配種23次，每天上午、下午試情配種，配種開始后第四天手術(shù)胚胎移植。②按常規(guī)輸精法，將輸卵器插入宮頸，并深入黃體側(cè)子宮角，將胚胎移入。②收集外形整齊，大小一致，卵裂球分裂均勻，外膜完整的清晰明亮的桑椹胚或適宜胚期的胚胎，吸入塑料細管內(nèi)（用五段法：移卵液—空氣—含有移卵液的胚胎—空氣—移放液）再將細管放入輸卵器中胚胎的移植（授卵）。⑧用100ml注射器及取38℃的沖卵液4060ml，注入子宮角，再回收沖卵液，反復(fù)沖洗，一側(cè)子宮角總計用沖卵液50ml,一側(cè)子宮角沖完，以同樣方法沖洗另一側(cè)子宮角，二側(cè)沖完，向子宮的內(nèi)注入抗菌藥物。⑥將帶有通心鋼絲的采卵軟管插入子宮角。④組裝沖卵集卵的裝置，準備1000ml沖卵液加溫到38℃?zhèn)溆?。②肌肉注射靜松靈35ml作鎮(zhèn)靜。以后處理同第一種方法，在第一次輸精同時注射LH 160IU，共輸精3次?；蛴肍SH在供體手性周期的第1114天每日上午8時下午5時各肌肉注射FSH50IU，總劑量400IU，第13天注射PGF2α2030mg,三、實驗方法（一）牛的非手術(shù)法胚胎移植與超數(shù)排卵處理受體牛胚胎移植前第6天注射PMSG500—800IU，前3—4天注射PGF2α12mg（子宮灌注法）。藥品：PMSG、FSH、LH、PGF2α、靜松靈注射液、普魯卡因注射液、PBS、抗菌素等。一、實驗?zāi)康耐ㄟ^應(yīng)用激素對牛、羊進行超數(shù)排卵及同期發(fā)情處理，以及胚胎移植全過程的觀察，了解動物胚胎移植的程序，主要技術(shù)環(huán)節(jié)操作要領(lǐng)。實驗十三四、作業(yè)將你觀察到的正常受精卵及未受精卵、畸形卵繪圖說明?；偷奈词芫押褪芫延捎诼鸭毎墒爝^程不正?；虍惓－h(huán)境因素的影響，而發(fā)生畸型卵如小卵、巨卵、橢圓卵、扁形卵、透明帶破裂，帶有大極體或細胞質(zhì)內(nèi)有大空泡等。另外，如果卵未受精，則卵子細胞質(zhì)碎裂為許多（2—20）大小不同的碎塊，每一塊中含有核的碎塊。第一極體大多消失早，排卵后即已不見，如果受精卵最后完成成熟，放出第二極體。受精卵的鑒別不同的動物，從卵巢中排出的卵子成熟程度不同，馬、驢和狗，在第一次成熟分裂沒有完成時排出。鼠類及貓、狗等動物，可見有發(fā)達的放射冠，而馬、牛、羊、豬等動物在排卵后不久，放射冠即消失，也有報導(dǎo)牛在排卵后9—14小時之內(nèi)放射冠即脫落。故胚胎移植時要求透明帶必須是完整無損的。屬粘多糖蛋白，含有透明質(zhì)酸，它有彈性，用針很難刺入。細胞質(zhì)進一步收縮，卵黃周隙就進一步擴大。動物新排出的卵子，在卵黃膜外，還具有透明帶和放射冠兩種結(jié)構(gòu)。因動物種類不同，卵細胞質(zhì)內(nèi)所含卵黃素顆粒和脂滴的量不同，因此卵的外觀也有差異。觀察正常卵子形態(tài)動物的卵子多呈圓球形，內(nèi)含有一個球形核，核內(nèi)有1—2個核仁，細胞質(zhì)含量豐富，其中貯存有卵物質(zhì)，和一般生物細胞一樣也含有線粒體和內(nèi)網(wǎng)器，細胞膜很薄，通常稱為卵黃膜。（3）集卵杯、小燒杯等。正常胚胎和非正常胚胎。一、實驗?zāi)康耐ㄟ^實習(xí)，熟悉動物卵子的形態(tài)結(jié)構(gòu)，初步區(qū)分正常和非正常的胚胎，練習(xí)掌握觀察胚胎技術(shù)，為掌握胚胎移植技術(shù)打下基礎(chǔ)。實驗十二母豬的輸精發(fā)情母豬輸精可在圈內(nèi)站立，將豬用橡膠輸精管輕輕從陰門插入陰道，左右旋轉(zhuǎn)前后轉(zhuǎn)動直至子宮頸深部，這時將裝有精液的注射器接上橡膠輸精管，將精液徐徐注入子宮內(nèi)，母豬輸精量一般為2540ml，輸精完畢，輕輕抽出輸精管，在母豬背上用力一壓，以減少精液倒流。抽出吸管，然后在另一側(cè)子宮角重復(fù)上述過程，再輸一次，這樣可大大提高受精率。首先在下腹正中線的左側(cè)用7毫米的套管和探針打一孔，充氣后放入窺鏡管；在下腹正中線的右側(cè)插進一個5毫米的套管和探針，用于尋找子宮角。首先保定母羊，保定人員將母羊尾向上拉起，輸精員用開張器打開陰道，找到子宮頸外口，—，緩緩注入精液， ，輸精完畢，小心取出輸精器和開張器在羊腰背部拍一下，以防精液倒流。母羊的輸精輸精完畢，小心取出輸精器和開張器，壓其背部以防母牛拱背使精液倒流。涂抹少量潤滑劑。母牛輸精有陰道開張器法和直腸把握法二種，后法須一定技術(shù)，但受胎率高。檢查精液品質(zhì)：—。四、輸精方法（一）輸精前的準備工作輸精器械的清洗消毒：金屬開張器先以火焰消毒，再以75%酒精棉球消毒，輸精器用蒸煮消毒或75%酒精消毒，再以生理鹽水沖洗23次。棄去膠質(zhì)部分，于室內(nèi)進行精液品質(zhì)檢查，并進行稀釋保存。公豬俯伏在采精臺上不動，表示開始射精，立即用集精杯收集精液。采精員一只手帶乳膠手套，一只手拿集精杯（冬天最好是保溫杯）并在集精杯口扎上雙層消毒紗布，以過濾精液，除去膠質(zhì)。假陰道、集精杯等用過后應(yīng)清洗消毒，以備下次使用。打開活塞，放出空氣和部分溫水，使精液完全流入集精杯，回到室內(nèi)取下集精杯。假陰道的方向與陰莖自然方向一致，約與水平線呈35176。采精前，須對公牛進行適當?shù)目刂疲匾獣r可作數(shù)次空爬，以增強性欲和增加采精量，直到公牛陰莖充分勃起，排出少量分泌液時才令其爬跨。用溫水將母牛外陰道用周圍洗滌干凈，并用清潔紗布抹干。二、實驗材料公畜、臺畜、采精架、假陰道、乳膠手套、長柄鉗子、瓷盤、集精瓶、貯精瓶、電刺激采精器；母畜、陰道開張器、輸精器、卡蘇槍、輸精膠管、注射器、內(nèi)窺鏡、光源燈、氧氣瓶、熱水桶、水浴鍋、干燥箱、消毒桶、固定架；酒精棉球、凡士林、滅菌紗布、溫度計。 動物的采精與輸精子宮內(nèi)液體的性狀?？煞衩阶訉m體、子宮、胎盤以及胎盤的大小。（四）母牛妊娠診斷主要觸摸以下項目子宮角的位置、質(zhì)地、形狀、大小和對稱程度。排卵期：卵泡破裂排卵，卵泡液流失成一小凹陷，排卵后5—8h黃體開始生成。卵泡發(fā)育期：卵泡增大到1— 波動明顯，此期后期發(fā)情已不大明顯。再向前觸摸，可摸到分叉的圓柱狀即為一對子宮角，沿子宮角大彎向外側(cè)下行，即可摸到呈扁圓形，柔軟而有彈性的卵巢。手伸入直腸達骨盆腔中部，將手掌展平向下壓腸壁，可觸摸到一個質(zhì)地堅實較硬的子宮頸，用拇指、中指和無名指握住子宮頸。（二）直腸檢查的方法檢查者站于母牛身后，手成錐形，輕輕插入直腸，緩緩向里推進。三、實驗內(nèi)容（一）直腸檢查前的準備工作將母牛保定于六柱欄中，尾巴拉向一側(cè)，清洗陰戶。 母牛的直腸檢查一、實驗?zāi)康氖煜つ概Ｂ殉?、子宮、子宮頸的自然位置、大小、形狀、質(zhì)地和相互關(guān)系，掌握直腸檢查的基本操作方法，為在生產(chǎn)實踐中鑒定母牛發(fā)情狀態(tài)、妊娠診斷和檢查卵巢子宮疾病奠定基礎(chǔ)。 試述就觀察到的母牛、母羊和母豬有哪些發(fā)情表現(xiàn)。四、作業(yè)卵泡中央部的血管崩解，血液外溢，血管形態(tài)模糊，卵泡壁染紅。排卵前約5～7小時，卵泡壁進一步變薄，出現(xiàn)較細的血管網(wǎng)。卵泡壁很薄，卵泡內(nèi)充滿半透亮的暗紅色的卵泡液。（四）腹腔鏡法通過腹腔鏡觀察到，排卵前卵巢體積達到最大，系膜內(nèi)的血管很粗。母豬的性欲表現(xiàn)發(fā)情母豬當聽到公豬叫聲，則四處張望，當公豬接近時，頓時變得溫順安靜，接受公豬交配。母羊的性欲表現(xiàn)發(fā)情母羊隨著發(fā)情時間的發(fā)展，表現(xiàn)有強烈的交配欲，如主動接近公羊，接受爬跨。由試情公牛在牛群中尋找發(fā)情母牛。（三）性欲表現(xiàn)母牛的性欲表現(xiàn)（1）將母牛拴在牛舍或交配架內(nèi)（樹上亦可），牽公牛接近母牛，如果母牛發(fā)情，則當試情公牛接近時，母牛安靜不動，并彎背拱腰，作交配姿勢。羊的放大200倍觀察。也可用10% AgNO3溶液滴于玻片上，待其自然干燥后在顯微鏡下鏡檢。（3）將沾取的粘液均勻地涂抹于載玻片上。粘液抹片法（1）用經(jīng)消毒的開張器擴張陰道。④觀察陰道應(yīng)特別注意陰道粘膜的色澤及濕潤程度，子宮頸口是否開張及其開張程度。②當開張器的前1/3進入陰門后，即改成水平方向插入陰道，同時以順時針或反時針方向放置開張器，使其柄部向下。（2）方法步驟①用左手拇指和食指（或中指）開張陰門，以右手轉(zhuǎn)開張器把柄向右或向左。如果準備用手臂檢查，洗滌及消毒范圍應(yīng)該上至尾根，兩側(cè)達到臀端外側(cè)。外陰部的洗滌和清毒：先用溫水（或肥皂、23%的蘇打水等）洗凈外陰部，然后用1%煤酚皂溶液進行消毒，最后用消毒紗布或酒精棉球擦干。母豬的發(fā)情表現(xiàn)在各種母畜中表現(xiàn)最為強烈，食欲劇減甚至廢絕，在圈內(nèi)不停走動，碰撞騷擾，拱地，啃嚼門閂企圖外出，不停爬跨其它母豬，而且也接受其它母豬的爬跨。陰道排出蛋清樣的粘液，打開陰道從開張器中間滴溜垂落地下。明顯的特征是接受其它母牛的爬跨，拱腰站立不動，